МКОУ "СОШ с. Псыншоко"

МКОУ "СОШ с. Псыншоко"

Добро пожаловать на наш сайт!

Гпк рф обязанность доказывания: ГПК РФ Статья 56. Обязанность доказывания / КонсультантПлюс

Бремя доказывания по ГПК РФ (часть 1)

В гражданском судопроизводстве действует принцип состязательности сторон, при котором бремя доказывания по ГПК РФ имеет ключевое значение.

В рамках гражданского процесса суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались. Также существует фундаментальное правило, что каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом (ст. 56 ГПК РФ).

Бремя доказывания по ГПК РФ является условной категорией, которая позволяет сторонам по делу определиться с доказательствами, которые относятся к делу. Безусловно, это ни как не ограничивает права сторон на предоставление тех доказательств, которые они считают необходимыми.

Бремя доказывания распределяется судом после принятия заявления (искового заявления) в суд, так как судья вправе приступить к подготовке дела к судебному разбирательству только после возбуждения гражданского дела в суде и вынесения определения о принятии заявления к производству суда.

Недопустимо совершение действий по подготовке дела к судебному разбирательству и распределению бремени доказывания до его возбуждения в суде, поскольку такие действия противоречат положениям статьи 147 ГПК РФ

После принятия заявления (искового заявления) судья выносит определение о подготовке дела к судебному разбирательству, указав в нем конкретные действия, которые следует совершить сторонам и другим лицам, участвующим в деле, а также сроки совершения этих действий.

Определение о проведении подготовки к судебному разбирательству обжалованию не подлежит, поскольку не исключает возможности дальнейшего движения дела.

При подготовке дела к судебному разбирательству уточняются обстоятельства, имеющие значение для правильного разрешения дела, и должны быть совершены действия судьи и лиц, участвующих в деле, по определению юридических фактов, лежащих в основании требований и возражений сторон, с учетом характера спорного правоотношения и норм материального права, подлежащих применению.

В случае заблуждения сторон относительно фактов, имеющих юридическое значение, судья на основании норм материального права, подлежащих применению, разъясняет им, какие факты имеют значение для дела и на ком лежит обязанность их доказывания.

В Постановлении Пленума Верховного Суда РФ от 24.06.2008 года № 11 «О подготовке гражданских дел к судебному разбирательству» указано, что необходимо обратить внимание судов на то, что, по смыслу статей 4, 45, 46, 47, 56, 57 ГПК РФ, обязанность доказывания лежит на сторонах, третьих лицах, заявляющих самостоятельные требования относительно предмета спора, на прокуроре, органах, организациях и гражданах, подавших заявление в защиту иных лиц.

По делам об установлении фактов, имеющих юридическое значение, рассматриваемых в порядке особого производства, на заявителях лежит обязанность привести доказательства, подтверждающие невозможность получения ими надлежащих документов или невозможность восстановления утраченных документов (статья 267 ГПК РФ).

По делам особого производства не исключается право суда истребовать необходимые доказательства по собственной инициативе (часть 1 статьи 272 ГПК РФ).

Согласно ст. 153 ГПК РФ судья, признав дело подготовленным, выносит определение о назначении его к разбирательству в судебном заседании. При этом судья обязан известить стороны, других лиц, участвующих в деле, о времени и месте рассмотрения дела, а также вызвать других участников процесса в соответствии с требованиями статей 113 и 114 ГПК РФ.

В некотором понимании бремя доказывания по ГПК РФ путем распределения между сторонами и другими лицами, участвующими в деле, не является обязанностью сторон, за неисполнение которой могут наступить неблагоприятные последствия в сфере материального права.

Однако при  неявке в судебное заседание ответчика, надлежаще извещенного о времени и месте судебного заседания, по делу может быть вынесено заочное решение, если истец (его представитель) не возражает против этого. Отчасти это может быть негативным последствием для ответчика, который не выяснил бремя доказывания по ГПК РФ.

Бремя доказывания по ГПК РФ имеет особенности по гражданским делам разных категорий, которые условно можно классифицировать по: предмету, объекту, способу защиты, субъектному составу.

Статья 56 ГПК РФ. Обязанность доказывания

Гражданский процессуальный кодекс Российской Федерации:

Статья 56 ГПК РФ. Обязанность доказывания

1. Каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом.

2. Суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались.

3. Каждое лицо, участвующее в деле, должно раскрыть доказательства, на которые оно ссылается как на основание своих требований и возражений, перед другими лицами, участвующими в деле, в пределах срока, установленного судом, если иное не установлено настоящим Кодексом.


Вернуться к оглавлению документа: Гражданский процессуальный кодекс РФ

Комментарии к статье 56 ГПК РФ, судебная практика применения

С 01.10.2019 года в статью 56 ГПК РФ введена часть 3, где указано, что каждое лицо, участвующее в деле, должно раскрыть доказательства, на которые оно ссылается… Указанная норма права является новой для гражданского процесса. Рекомендуем подробнее статью «Раскрытие доказательств по ГПК РФ и АПК РФ. Понятие».


В п. 10 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 24.06.2008 N 11 «О подготовке гражданских дел к судебному разбирательству» содержатся следующие разъяснения:

Бремя доказывания лежит на стороне, ссылающейся на обстоятельства в обоснование своих требований

Обратить внимание судов на то, что, по смыслу статей 4, 45, 46, 47, 56, 57 ГПК РФ, обязанность доказывания лежит на сторонах, третьих лицах, заявляющих самостоятельные требования относительно предмета спора, на прокуроре, органах, организациях и гражданах, подавших заявление в защиту иных лиц.

По делам об установлении фактов, имеющих юридическое значение, рассматриваемых в порядке особого производства, на заявителях лежит обязанность привести доказательства, подтверждающие невозможность получения ими надлежащих документов или невозможность восстановления утраченных документов (статья 267 ГПК РФ).

По делам особого производства не исключается право суда истребовать необходимые доказательства по собственной инициативе (часть 1 статьи 272 ГПК РФ).

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 56 ГПК РФ

1. Каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом.

2. Суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались.

3. Каждое лицо, участвующее в деле, должно раскрыть доказательства, на которые оно ссылается как на основание своих требований и возражений, перед другими лицами, участвующими в деле, в пределах срока, установленного судом, если иное не установлено настоящим Кодексом.

Комментарий к Статье 56 Гражданского процессуального кодекса

Комментируемая статья возлагает обязанность доказывания на стороны.

В соответствии с ч. 1 комментируемой статьи 56 ГПК РФ каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом.

Часть 2 комментируемой статьи устанавливает, что суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались.

Из содержания названной статьи следует, что, во-первых, обязанность доказывания возлагается на стороны; во-вторых, каждая сторона доказывает обстоятельства, определяемые на основании своих требований и возражений; в-третьих, федеральным законом могут быть определены исключения относительно распределения обязанностей по доказыванию; в-четвертых, только суд определяет обстоятельства, имеющие значение для дела, и какой стороне надлежит их доказывать; в-пятых, суд вправе вынести на обсуждение любые обстоятельства, даже если стороны на них не ссылались.

Отметим, что обязанность доказывания может быть возложена и на третье лицо, заявляющее самостоятельные требования, которое обязано доказать обстоятельства, положенные в обоснование своих требований.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

В соответствии с разъяснениями, данными в п. 29 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 19 июня 2012 г. N 13 «О применении судами норм гражданского процессуального законодательства, регламентирующих производство в суде апелляционной инстанции», «если судом первой инстанции неправильно определены обстоятельства, имеющие значение для дела (пункт 1 части 1 статьи 330 ГПК РФ), то суду апелляционной инстанции следует поставить на обсуждение вопрос о представлении лицами, участвующими в деле, дополнительных (новых) доказательств и при необходимости по их ходатайству оказать им содействие в собирании и истребовании таких доказательств.

Суду апелляционной инстанции также следует предложить лицам, участвующим в деле, представить дополнительные (новые) доказательства, если в суде первой инстанции не доказаны обстоятельства, имеющие значение для дела (пункт 2 части 1 статьи 330 ГПК РФ), в том числе по причине неправильного распределения обязанности доказывания (часть 2 статьи 56 ГПК РФ)» <1>.
———————————
<1> Российская газета. 2012. N 147.

Отказывая в принятии к рассмотрению жалобы гражданина А.С.Л. на нарушение его конституционных прав ч. 2 ст. 56 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации, Конституционный Суд РФ в Определении от 29 мая 2012 г. N 963-О указал, что «в своей жалобе в Конституционный Суд Российской Федерации гражданин А.С.Л. оспаривает конституционность части второй статьи 56 (об обязанности доказывания) ГПК Российской Федерации. По мнению заявителя, данное законоположение как позволяющее суду по собственной инициативе произвольно определять, какие обстоятельства имеют существенное значение для разрешения дела, противоречит статье 19 (часть 1) Конституции Российской Федерации.

Конституционный Суд Российской Федерации, изучив представленные А.С.Л. материалы, не находит оснований для принятия его жалобы к рассмотрению.

Норма части второй статьи 56 ГПК Российской Федерации, в соответствии с которой суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались, является процессуальной гарантией правильного рассмотрения и разрешения судом гражданских дел и — во взаимосвязи с частью третьей статьи 196 и частью четвертой статьи 198 данного Кодекса, обязывающими суд принимать решение по заявленным истцом требованиям, указывать в мотивировочной части решения обстоятельства дела, установленные судом, доказательства, на которых основаны выводы суда об этих обстоятельствах, и доводы, по которым суд отвергает те или иные доказательства, — не предполагает произвольного применения, а потому не может расцениваться как нарушающая права заявителя, перечисленные в жалобе» <1>.

———————————
<1> Определение Конституционного Суда РФ от 29 мая 2012 г. N 963-О.

Часть 1 ст. 56 ГПК РФ предусматривает исключения из общего правила по обязанности доказывания, которые установлены федеральным законом, например следующие.

1. Часть 1 ст. 330 ГК РФ, в соответствии с которой неустойкой (штрафом, пеней) признается определенная законом или договором денежная сумма, которую должник обязан уплатить кредитору в случае неисполнения или ненадлежащего исполнения обязательства, в частности в случае просрочки исполнения. По требованию об уплате неустойки кредитор не обязан доказывать причинение ему убытков <1>.
———————————
<1> Собрание законодательства РФ. 1994. N 32. Ст. 3301.

В п. 73 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 24 марта 2016 г. N 7 «О применении судами некоторых положений Гражданского кодекса Российской Федерации об ответственности за нарушение обязательств» разъяснено, что «бремя доказывания несоразмерности неустойки и необоснованности выгоды кредитора возлагается на ответчика. Несоразмерность и необоснованность выгоды могут выражаться, в частности, в том, что возможный размер убытков кредитора, которые могли возникнуть вследствие нарушения обязательства, значительно ниже начисленной неустойки (часть 1 статьи 56 ГПК РФ, часть 1 статьи 65 АПК РФ)» <1>.
———————————
<1> Российская газета. 2016. N 70.

2. Статья 401 ГК РФ предусматривает ответственность за нарушения обязательства, в ч. 2 данной статьи указано, что отсутствие вины доказывается лицом, нарушившим обязательство.

Пленум Верховного Суда в п. 5 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 24 марта 2016 г. N 7 «О применении судами некоторых положений Гражданского кодекса Российской Федерации об ответственности за нарушение обязательств» разъяснил следующее: «Вина должника в нарушении обязательства предполагается, пока не доказано обратное. Отсутствие вины в неисполнении или ненадлежащем исполнении обязательства доказывается должником (пункт 2 статьи 401 ГК РФ).

Если должник несет ответственность за нарушение обязательства или за причинение вреда независимо от вины, то на него возлагается бремя доказывания обстоятельств, являющихся основанием для освобождения от такой ответственности, например обстоятельств непреодолимой силы (пункт 3 статьи 401 ГК РФ)» <1>.
———————————
<1> Там же.

3. Статья 13 Закона РФ от 7 февраля 1992 г. N 2300-1 «О защите прав потребителей» гласит: «Изготовитель (исполнитель, продавец, уполномоченная организация или уполномоченный индивидуальный предприниматель, импортер) освобождается от ответственности за неисполнение обязательств или за ненадлежащее исполнение обязательств, если докажет, что неисполнение обязательств или их ненадлежащее исполнение произошло вследствие непреодолимой силы, а также по иным основаниям, предусмотренным законом» <1>.
———————————
<1> Собрание законодательства РФ. 1996. N 3. Ст. 140.

Согласно Обзору Верховного Суда Российской Федерации по отдельным вопросам судебной практики о применении законодательства о защите прав потребителей при рассмотрении гражданских дел (утвержденному Президиумом Верховного Суда РФ 1 февраля 2012 г.) «по общему правилу бремя доказывания обстоятельств, освобождающих от ответственности за неисполнение либо ненадлежащее исполнение обязательства, возникшего в сфере защиты прав потребителей, лежит на продавце (изготовителе, исполнителе, уполномоченной организации или уполномоченном индивидуальном предпринимателе, импортере)» <1>.
———————————
<1> Бюллетень Верховного Суда РФ. 2012. N 4.

4. Согласно ч. 2 ст. 68 ГПК РФ признание стороной обстоятельств, на которых другая сторона основывает свои требования или возражения, освобождает последнюю от необходимости дальнейшего доказывания этих обстоятельств.

Отметим, что комментируемая статья 56 ГПК России возлагает обязанность доказывания на стороны, а ст. 57 ГПК РФ обязанность предоставления и истребования доказательств возлагает на стороны и других лиц, участвующих в деле.

Более того, ст. 35 ГПК РФ наделяет всех лиц, участвующих в деле, правом на представление доказательств.

Можно заключить, что обязанность доказывания возлагается на лиц, участвующих в деле.

Статья 56 ГПК РФ. В новой редакции ст. с изменениями. Комментарии

(официальная действующая редакция, с последними изменениями, полный текст статьи 56 ГПК РФ с комментариями)


1. Каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом.

2. Суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались.

3. Каждое лицо, участвующее в деле, должно раскрыть доказательства, на которые оно ссылается как на основание своих требований и возражений, перед другими лицами, участвующими в деле, в пределах срока, установленного судом, если иное не установлено настоящим Кодексом.


Комментарий к статье 56 ГПК РФ в новой редакции с изменениями

Порядок распределения бремени доказывания в суде регламентируется комментируемой статьей 56 ГПК РФ в новой редакции. Данная статья определяет одно из самых важных правил в рассмотрении судом гражданских дел: доказывать обстоятельства должна та сторона, которая на них ссылается. Исключение составляют только общеизвестные факты. Из этого правила вытекают важнейшие следствия. Если истец в ходе судебного разбирательства не может доказать обстоятельства, на которых базируются его исковые требования, то суд откажет ему в иске.

Согласно статье 56 ГПК РФ с изменениями суд не только имеет право, но и обязан определить, какие обстоятельства важны для установления истины, и какой стороне необходимо их доказать. Судья в ходе подготовки к рассмотрению дела устанавливает, какие обстоятельства важны для всестороннего рассмотрения иска, и распределяет между участниками процесса, что и какая из сторон должна их доказывать.

В гражданском праве есть две презумпции вины. Суть их состоит в том, что лицо, причинившее вред или нарушившее обязательства, заранее признается виновным. И именно оно должно доказать в суде отсутствие вины в своих действиях.

Есть тонкости при рассмотрении дел о защите чести и достоинства. Истец вправе потребовать опровержения порочащих его сведений, если ответчик не сумеет в суде доказать, что они соответствуют действительности. Другими словами, истец на основании ч. 1 ст. 152 ГК РФ должен только доказать, что порочащие сведения были распространены второй стороной, а ответчик обязан убедить суд, что информация правдива.

Соблюдая принципы состязательности сторон, суд не вправе проводить сбор доказательств по собственной инициативе. В отдельных случаях, когда участник процесса не может сам получить необходимое для объективного рассмотрения дела доказательство, суд идет ему навстречу и направляет письменный запрос (см. комментарии к ст. 57 ГПК РФ).  По делам, которые рассматриваются в особом производстве (установление судом важных фактов, например, о неточностях и ошибках в документах), суд имеет право по своему усмотрению направлять запросы в соответствующие органы.

Нарушение принципов гражданского судопроизводства, изложенных в статье 56 ГПК РФ в новой редакции, ведет к отмене судебного решения.

Статья 56 ГПК РФ — дополнительный комментарий

В ч. 1 ст. 56 ГПК РФ с изменениями закреплено общее правило распределения обязанностей по доказыванию, которое в праве существует давно, со времен римского права, и выражается в формуле: «Доказывает тот, кто утверждает». Эта норма сформулирована применительно к обязанностям сторон в состязательном, т.е. исковом производстве. Однако равнозначная обязанность по доказыванию оснований своего заявления лежит и на заявителе в делах особого производства и в делах иных неисковых производств, и на заинтересованных лицах. Обязанность по доказыванию оснований своих требований несут прокурор, предъявивший иск в интересах других лиц (см. комментарии к ст. 45 ГПК), и организации, а также отдельные граждане, защищающие права других лиц (см. комментарии к ст. 46 ГПК).

Обязанность доказывания понимается в специфическом для гражданского процессуального права смысле. Обязанность в праве есть мера должного поведения, обеспеченная санкцией в случае нарушения. В нормах же гражданского процессуального права нет специальных санкций, обеспечивающих выполнение сторонами и другими заинтересованными лицами обязанности по доказыванию. Движущим стимулом, побуждающим стороны к активной процессуальной деятельности по доказыванию, выступает интерес в получении благоприятного решения. В монографической юридической литературе обосновывается также суждение, что обязанность по доказыванию обеспечивается специфическими процессуальными санкциями, а именно отменой необоснованного решения, другими невыгодными процессуальными последствиям.

Нормы материального права с выполнением обязанности по доказыванию связывают благоприятные правовые последствия для стороны. Например, ст. 178 ГК предусматривает, что сторона, по иску которой сделка признана недействительной, вправе требовать от другой стороны возмещения расходов, утраты или повреждения своего имущества, если докажет, что заблуждение возникло по вине другой стороны.

Обязанности по доказыванию распределяются между сторонами на основании общего правила, указанного в ч. 1 ст. 56 ГПК РФ. Слова в ч. 1 ст. 56 ГПК в действующей редакции «если иное не предусмотрено федеральным законом» означают возможность применения частных правил, содержащихся в нормах как процессуального, так и материального права. Чаще всего в нормы материального права включаются доказательственные презумпции, которые в отступление от общего правила возлагают обязанность доказывания факта или его опровержения не на ту сторону, которая о нем утверждает, а на противоположную. В нормах материального гражданского права наиболее распространены две доказательственные презумпции:

  1. презумпция вины причинителя вреда;
  2. презумпция вины лица, не исполнившего обязательство или исполнившего его ненадлежащим образом.

В нормах семейного, трудового права также имеются презумпции, изменяющие общее правило доказывания. Так, происхождение ребенка от родителей, состоящих между собой в зарегистрированном браке, удостоверяется записью о браке родителей. Если ответчик по делам о взыскании алиментов считает запись отцовства недействительной, на нем лежит обязанность доказывания фактов, свидетельствующих о недействительности записи отцовства.

Если между администрацией и работником заключен письменный договор о полной материальной ответственности последнего за вверенные ему ценности, то в случае причинения ущерба на нем лежит обязанность доказывания отсутствия вины в причинении ущерба или создании ненадлежащих условий со стороны администрации для хранения ценностей.

Основания от освобождения от доказывания предусмотрены также в ст. 61 ГПК РФ.

Обязанность по доказыванию исполняется представлением доказательств, заявлением ходатайств об их истребовании, указанием суду на них, т.е. сообщением места нахождения доказательств, ознакомления с доказательствами, имеющимися в гражданском деле, путем участия в их исследовании. Доказательства представляются на любой стадии процесса до удаления суда в совещательную комнату для вынесения решения. Нельзя отказывать в принятии искового заявления или оставлять его без движения по мотивам непредставления стороной доказательств.

Содержание комментируемой ст. 56 ГПК РФ следует рассматривать в контексте п. 3 ст. 123 Конституции РФ и ст. 12 ГПК РФ, закрепляющих принцип состязательности гражданского судопроизводства и принцип равноправия сторон в условиях перехода экономической системы к рыночной экономике. Усиливается роль самих сторон в осуществлении доказательственной деятельности, в отстаивании и защите своих прав. Из закона исключена норма о собирании доказательств по инициативе самого суда при отсутствии ходатайств и просьб спорящих сторон или заявителя об этом.

Часть 2 ст. 56 ГПК РФ в новой редакции, с изменениями, фиксирует обязанность суда по отношению к предмету доказывания. Предмет доказывания есть совокупность юридических фактов основания иска и возражений против него, а также иных фактов, имеющих значение для правильного разрешения дела. Суд определяет юридическое значение фактических обстоятельств и разъясняет каждой стороне обязанность их доказывания. Во избежание перехода судопроизводства на принцип «формальной истины» закон закрепил правило восполнительной по отношению к сторонам деятельности суда: суд должен определить полный объем юридически значимых по делу фактов и вынести их на обсуждение, если стороны по незнанию закона или иным причинам на них не ссылаются. В этом случае суд обязывает сторону представить доказательства в подтверждение имеющего значение факта. 

Отсутствие в ст. 56 ГПК РФ ранее существовавшей нормы, в соответствии с которой суд не ограничивался при рассмотрении и разрешении гражданских дел доказательствами, представленными сторонами, а собирал их по своей инициативе, не означает, что современный гражданский процесс в России основывается на принципе «формальной истины» и суд не должен достигать объективной истины, т.е. верных суждений о фактических обстоятельствах по делу. Нельзя принять в качестве основы для процессуальной доказательственной деятельности ложное утверждение, встречающееся в научных источниках, что в связи с проведенными изменениями гражданского процессуального права «суд не должен устанавливать истину по гражданским делам».

Вопросы применения комментируемой статьи в судебной практике

Если я не ссылаюсь на какие-то обстоятельства, значит я не должен их доказывать в суде?

Суд определяет какие обстоятельства подлежат выяснению, какое они имеют значение для дела и какая сторона их будет доказывать.

Как я узнаю, что суд на меня возложил обязанность доказывания?

Суд указывает обстоятельства в определении о подготовке к рассмотрению дела. Там же определяет, какая из сторон будет доказывать эти обстоятельства. Распределение бремени доказывания указывается в извещении .которое направляется сторонам в ходе подготовки к рассмотрению дела.

Что такое бремя доказывания?

Бремя доказывания — это обязанность стороны доказать указанные судом обстоятельства.

Статья 56 ГПК РФ. Обязанность доказывания. Актуально в 2020 и 2021. Последняя редакция

1. Каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом.2. Суд определяет, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, выносит обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались.3. Каждое лицо, участвующее в деле, должно раскрыть доказательства, на которые оно ссылается как на основание своих требований и возражений, перед другими лицами, участвующими в деле, в пределах срока, установленного судом, если иное не установлено настоящим Кодексом.

Комментарии к статье

Комментарий к Гражданскому процессуальному кодексу Российской Федерации (постатейный, научно-практический) (2-е издание, переработанное и дополненное) (отв. ред. Ю.Ф. Беспалов) («Проспект», 2017)

Комментарий к главе 22 «Заочное производство» ГПК РФ от 14 ноября 2002 г. № 138-ФЗ (постатейный) (Никулинская Н.Ф.) (Подготовлен для системы КонсультантПлюс, 2017)

Гражданский процесс: Учебник (5-е издание, переработанное и дополненное) (под ред. М.К. Треушникова) («Статут», 2014)

Комментарий к Гражданскому процессуальному кодексу Российской Федерации (Загидуллин М.Р.) («Вестник гражданского процесса», 2018, № 2)

Фактические основания отвода судьи в гражданском процессе. Комментарий к ст. 16 ГПК РФ (Рыжаков А.П.) (Подготовлен для системы КонсультантПлюс, 2019)

Отвод прокурора, помощника судьи, секретаря судебного заседания, эксперта, специалиста, переводчика. Комментарий к ст. 18 ГПК РФ (Рыжаков А.П.) (Подготовлен для системы КонсультантПлюс, 2019)

Разумный срок судопроизводства (Подготовлен для системы КонсультантПлюс, 2020)

Упрощенные производства в гражданском судопроизводстве (Бортникова Н.А.) (Подготовлен для системы КонсультантПлюс, 2019)

Оценка доказательств в гражданском судопроизводстве (Салманидина А.С.) («Российская юстиция», 2019, № 12)

Практика ГПК РФ. Статья 56 (ч. 2). Обязанность доказывания

Для поиска на сайте однородных и связанных материалов воспользуйтесь меткой внизу страницы. Чтобы просмотреть содержание категории (раздела, страницы), воспользуйтесь активной, ссылкой голубого цвета, расположенной в верхней части страницы. После активации ссылки откроется перечень статей категории в кратком виде.

На этой странице публикуются фрагменты  из частных, апелляционных, кассационных, надзорных и дисциплинарных жалоб.

 

ДЕЛО #,

Судом допущено нарушение ст. 5 (п. 3) закона от 07 февраля 2011 года N 1-ФКЗ «О судах общей юрисдикции в Российской Федерации» о равенстве перед судом: вопреки ст. 196 (ч. 1) суд не определил, каковы правоотношения сторон, какой закон должен быть применен по данному делу.


ДЕЛО #,

Судом допущено нарушение ст. 5 (п. 3) закона от 07 февраля 2011 года N 1-ФКЗ «О судах общей юрисдикции в Российской Федерации» о равенстве перед судом: вопреки ст. 196 (ч. 1) суд не определил, каковы правоотношения сторон, какой закон должен быть применен по данному делу.

Решением Мещанского районного суда г. Москвы суда от 05 сентября 2016 года удовлетворены исковые требования БСЯ к АЛ о взыскании долга по договору займа.  Доводы ответчицы АЛ о том, что по делу надлежит применить закон о договоре простого товарищества, судом отклонены. Определением от июля 2016 года суд определил обязать ответчица АЛ предоставить дополнительные доказательства в обоснование доводов о заключении договора простого товарищества. Ответчица в очередное заседание не явилась, дополнительных доказательств не представила.

26 января 2017 года решение отменено судебной коллегией апелляционной инстанции Мосгорсуда в составе судей  Сергеевой Л.А., Федерякиной Е.Ю. и Смирновой Ю.А..

Из апелляционного определения усматривается, что суд возложил на истца обязанность доказывания закона, подлежащего применению (характера правоотношений, правовой природы договора). 

Отменив решение, возложив на истицу обязанность доказывания возникновения между сторонами правоотношений по договору займа, посчитав, что расписки ответчицы и объяснений истицы не достаточно, вопреки закону и судебной практике, вопреки ст. 56 (ч. 2) суд не предложил истице представить дополнительные  доказательства и не указал какие.

Отменяя решение, судебная коллегия обязана была предложить истице представить дополнительные доказательства по следующим основаниям:

— отмена решения и принятие нового решения, новым составом суда, в силу свободы усмотрения и независимости при оценке доказательств, давшим иную оценку доказательствам истицы, представленным в суд первой инстанции;

— обеспечение истице равного права с ответчицей, которой при аналогичных обстоятельствах право на представление дополнительных доказательств было предоставлено судом первой инстанции;

— судебная практика, выступающая гарантией равенства перед законом и судом,  обязывающая суд в случае недостаточности доказательств, предложить стороне представить дополнительные доказательства;

Из оспариваемого апелляционного определения от 26 января 2017: » Из материалов дела следует, что в соответствии с распиской, на основании которой БСЯ предъявлен настоящий иск, АЛ «взяла деньги…для создания совместного бизнеса сроком на 1 год» с дополнительным упоминанием о том, что «если по непредвиденным обстоятельствам потребуется вернуть деньги раньше, то это будет воспринято положительно» (л.д.16). Тем самым, какого-либо указания на заемный характер данных денежных средств в названной расписке не содержится.

По мнению судебной коллегии, указанная расписка не является бесспорным доказательством того, что, обозначенные в ней денежные средства были фактически переданы АЛ, в качестве заемных средств в долг, а ее буквальное толкование не позволяет считать, что между сторонами возникли отношения по договору займа, поскольку содержание расписки не соответствует предмету данного вида договора, предусмотренного п.1 ст.807 ГК РФ.

Из материалов дела усматривается, что ответчик АЛ факт возникновения с БСЯ на основании означенной расписки заемных правоотношений категорически отрицает. При этом закон не допускает подтверждения факта передачи заемных денежных средств в долг только на основании утверждений истца.

Судебная коллегия приходит к выводу о том, что истец БСЯ в соответствии со ст.ст.12, 56 ГПК РФ не представила доказательства возникновения между сторонами заемных правоотношений.

судебная коллегия определила: Решение Мещанского районного суда города Москвы от 05 сентября 2016 года отменить. В удовлетворении исковых требований БСЯ к АЛ о взыскании заемных денежных средств, процентов за пользование денежными средствами, судебных расходов – отказать».

 

«11. Установив, что представленные доказательства недостаточно подтверждают требования истца или возражения ответчика либо не содержат иных необходимых данных, судья вправе предложить им представить дополнительные доказательства, а в случаях, когда представление таких доказательств для названных лиц затруднительно, по их ходатайству, отвечающему требованиям части 2 статьи 57 ГПК РФ, оказывает содействие в собирании и истребовании от организаций и граждан, в частности, письменных и вещественных доказательств (часть 1 статьи 57, пункт 9 части 1 статьи 150 ГПК РФ) «.

Постановление Пленума Верховного Суда от 24 июня 2008 года N 11 «О подготовке гражданских дел к судебному разбирательству»

К вопросу о роли суда при распределении бремени доказывания в гражданском процессе

Курносов Сергей Алексеевич, адвокат (Адвокатская контора Московского района НОКА)

Опубликовано «Нижегородский адвокат» №09-2018

 

 

В условиях нынешнего отсутствия принципа объективной истины в гражданском процессе важной задачей является доказывание обоснованности заявленных требований и возражений по иску.

Наверное, каждый практикующий цивилист сталкивался с тем, что представив определенные доказательства в обоснование своей позиции (полагая их вполне достаточными, к тому же, они никем по делу не оспаривались), в решении суда, тем не менее, он обнаруживал вывод о недостаточности представленных доказательств для признания обоснованности избранной позиции. Тем самым, в решении содержался как бы намек, что представитель тяжущейся стороны ресурс состязательности до конца не выработал.
Частью 1 статьи 56 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации предусмотрено, что каждая сторона должна доказать те обстоятельства, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений, если иное не предусмотрено федеральным законом. Вместе с тем, как неоднократно указывал Верховный Суд РФ (определения Судебной коллегии по гражданским делам от 7.06.2013 № 18-КГ13-38, от 9.04.2013 № 5-КПЗ-2), дословно: «часть 2 той же статьи, возлагает на суд обязанность определить, какие обстоятельства имеют значение для дела, какой стороне надлежит их доказывать, и предписывает суду выносить такие обстоятельства на обсуждение, даже если стороны на какие-либо из них не ссылались. В случае необходимости суд вправе предложить сторонам представить дополнительные доказательства, оказать им содействие в получении доказательств (статья 57 Гражданского процессуального кодекса Российской Федерации)».
Невыполнение указанных императивных требований части 2 ст. 56 Гражданского процессуального кодекса РФ и «непринятие мер к определению юридически значимых по делу обстоятельств», является нарушением процессуального права (определения кассационной инстанции Верховного Суда РФ от 14.05.2013 № 5-КГ13-33, от 5.10.2010 № 5-В10-67, от 7.06.2013 №18-КГ13-38, от 9.04.2013 № 5-КПЗ-2, апелляционное определение Нижегородского областного суда от 3.05.2015 № 33-2509/2015). В данных определениях Судебной коллегией Верховного Суда Российской Федерации дано четкое толкование части 2 ст. 56 ГПК РФ, причем без привязки к конкретным делам либо спорам. Соответственно, данные требования закона (ч.2 ст. 56 ГПК) должны выполняться неукоснительно – по всем приведенным выше определениям Верховным Судом вынесенные судебные постановления были отменены, а дела направлены на новое рассмотрение с формулировками о невыполнении нижестоящими судами требований части 2 ст. 56 ГПК РФ.
Применительно к этому аспекту существуют и другие фундаментальные положения, на которые стоит обращать внимание, но к сожалению, используются не всеми.
Как разъяснено в абз.2 п. 5 постановления Пленума Верховного Суда РФ 2008г № 11 «О подготовке гражданских дел к судебному разбирательству», в случае заблуждения сторон относительно фактов, имеющих юридическое значение, судья на основании норм материального права, подлежащих применению, разъясняет им, какие факты имеют значение для дела и на ком лежит обязанность их доказывания.
Согласно абз.1 п. 5 того же постановления Пленума, под уточнением обстоятельств, имеющих значение для дела, следует понимать действия судьи и лиц, участвующих в деле, по определению юридических фактов, лежащих в основании требований и возражений сторон, с учетом характера спорного правоотношения и норм материального права, подлежащих применению.
Невыполнение судом данных разъяснений представляет собой игнорирование требований ст.148 ГПК РФ, установившей в числе одной из задач подготовки гражданского дела к судебному разбирательству уточнение фактических обстоятельств, имеющих значение для правильного разрешения дела.
В свою очередь, в пункте 59 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 19.06.2012 N 13 разъяснено: «Если при рассмотрении дела суд апелляционной инстанции установит, что судом первой инстанции не проводилась подготовка дела к судебному разбирательству или такая подготовка была проведена не в полном объеме либо были допущены другие нарушения, которые привели к неправильному рассмотрению дела или к нарушению сроков его рассмотрения, суду апелляционной инстанции необходимо реагировать на допущенные нарушения вынесением частного определения».
В силу п. 21 постановления Пленума Верховного Суда РФ 2008г № 11 судья опрашивает истца или его представителя по существу заявленных требований (пункт 2 части 1 статьи 150 ГПК РФ) в целях выяснения характера этих требований, обстоятельств, на которых они основаны, и доказательств, подтверждающих эти обстоятельства. Все это, как далее гласит Пленум, «имеет значение для определения судьей закона, которым следует руководствоваться при разрешении дела и установлении правоотношений сторон, определении обстоятельств, имеющих значение для дела, и решения вопроса о распределении обязанностей по их доказыванию».
В п. 7 этого же постановления Пленума указано, что судья разъясняет, на ком лежит обязанность доказывания тех или иных обстоятельств. Установив, что представленные доказательства недостаточно подтверждают требования истца или возражения ответчика либо не содержат иных необходимых данных, судья вправе предложить им представить дополнительные доказательства. При этом судья должен выяснить, какими доказательствами стороны могут подтвердить свои утверждения, какие трудности имеются для предоставления доказательств.
В соответствии со ст. 12 ГПК РФ суд создает условия для всестороннего и полного исследования доказательств, установления фактических обстоятельств и правильного применения законодательства.
На основании всего изложенного, руководствуясь абзацем 4 п. 5 постановления Пленума «О судебном решении», где также указано, что заявленные требования рассматриваются и разрешаются по обстоятельствам, вынесенным судом на обсуждение, можно сделать вывод о том, что невыполнение судом своей прямой обязанности по вынесению на обсуждение сторон всех юридически значимых обстоятельств (даже тех, на которые стороны не ссылались), не соответствует установленным ст.2 ГПК РФ задачам гражданского судопроизводства по правильному рассмотрению и разрешению дела.
Помимо оснований к отмене вынесенных судебных постановлений и направлению дела на новое рассмотрение (о чем свидетельствуют указанные выше определения Верховного Суда РФ), невыполнение судом первой инстанции требований по вынесению на обсуждение юридически значимых обстоятельств должно являться и уважительной причиной для принятия апелляционной инстанцией новых доказательств, которые не предоставлялись в районный суд (определения Нижегородского областного суда от 24.06.14 № 33-2213/2014 и от 3.04.2015 № 33-2509/2015 – нераспределение судом бремени доказывания и невыполнение требований ст. 148 ГПК РФ является основанием для принятия новых доказательств).
В этой связи примечателен следующий подход. В определении от 24.06.2014 № 33-2213/2014 судебная коллегия по гражданским делам Нижегородского областного суда указала: «…. Между тем, придя к выводу о недостаточности имеющегося в материалах дела заключения…, суд 1 инстанции, тем не менее, на обсуждение сторон вопрос о назначении экспертизы не поставил…». По этой причине апелляционной инстанцией была назначена по делу судебная экспертиза.
В недавнем Обзоре судебной практики Верховного Суда РФ №2 2018г, утв. Постановлением Президиума от 4 июля 2018г, со ссылкой на определение Судебной коллегии по гражданским делам № 33-КГ17-10 выражен аналогичный подход «…суд апелляционной инстанции в нарушение положений ч. 2 ст. 56 ГПК РФ данные обстоятельства не учел, что повлияло на результат разрешения спора. Судом также не обсужден вопрос о том…».
Вышеозначенные примеры являются существенными нарушениями процессуального права, влияющими на исход дела, соответственно должны устраняться вышестоящими инстанциями, а при защите в суде интересов граждан и организаций будет весьма полезно заявлять перед судом соответствующее ходатайство о вынесении на обсуждение в порядке ч.2 ст. 56 ГПК РФ юридически значимых по делу обстоятельств, применительно к основанию и предмету иска, учитывая, что с учетом разъяснений пункта 6 постановления Пленума ВС РФ 2008г № 11 основанием иска являются именно фактические обстоятельства (а не доказательства). В свою очередь, в соответствии с императивными требованиями ст. 166 ГПК РФ ходатайства лиц, участвующих в деле, по вопросам, связанным с разбирательством дела, разрешаются на основании определений суда после заслушивания мнений других лиц, участвующих в деле. Таким образом, вынесение протокольного определения по приведенному ходатайству будет является обязанностью суда, рассматривающего дела.


 

Инженерное дело

Инженерное дело

РЕСУРСЫ КОРОНАВИРУСА: зданий IRWD закрыты, но мы поможем вам в этом. Щелкните здесь, чтобы просмотреть ссылки, часы работы, финансовую помощь и новости.

Инженерная документация. Руководящие указания. Требования.


Инженерная стойка находится в главном вестибюле офисов IRWD по адресу 15600 Sand Canyon Avenue в Ирвине.
Обратите внимание на часы работы инженерного счетчика:

Понедельник — четверг: 8.00 — 16.30 (обслуживание по телефону)

Выходные дни 2021 года: 1 января, 15 февраля, 2 апреля, 31 мая, 5 июля, 6 сентября, 25 ноября, 26 ноября, 23 декабря, 24 декабря, 31 декабря

Телефон: 949-453-5548
Электронная почта: [email protected]

Инженерный счетчик-календарь

  • Подача или получение планов улучшения: Планы развития и улучшения проверяются на соответствие стандартам округа.Требования к подаче документов можно найти в Процедурных правилах IRWD, доступных ниже.
  • Заявление на временный или постоянный счетчик воды: Информация о том, что брать с собой при подаче заявки на счетчик, включена в Лист требований к счетчику как для жилой, так и для нежилой недвижимости. Поскольку это обширный список требований, пожалуйста, ознакомьтесь с этим списком (доступным ниже) перед посещением Инженерной стойки.
  • Не уверены, нужно ли вам отправлять планы на утверждение? Отнесите свои планы на стойку разработки, чтобы обсудить требования с одним из инженеров IRWD Development Services.


Будьте в курсе технической документации с IRWD eNotify

Подпишитесь на eNotify , чтобы получать автоматические уведомления, когда обновленные документы становятся доступными в Интернете.


Сохранить

Сохранить

Управляемая структурами микробная направленность антистафилококковых пролекарств

Введение

Устойчивость к противомикробным препаратам представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения 1,2 .В 2019 году в США зарегистрировано 2,8 миллиона устойчивых к антибиотикам инфекций, в результате которых погибло 35000 человек 3 . По некоторым оценкам, к 2050 году инфекции, устойчивые к противомикробным препаратам, будут вызывать до 10 миллионов смертей ежегодно. 4 . Золотистый стафилококк — разрушительный патоген для человека. Метициллин-устойчивый S. aureus (MRSA) был назван «серьезной угрозой» Центрами по контролю и профилактике заболеваний 3,5,6 . Срочно необходимы новые противомикробные препараты, особенно с новыми механизмами действия; однако в большинстве разрабатываемых противоинфекционных препаратов используются преимущества существующих антибиотиков с доказанной эффективностью и установленными профилями безопасности 7,8 .Новые, химически отличные антибиотики очень желательны в качестве стратегии обхода устойчивости к противомикробным препаратам.

Многие метаболические процессы необходимы для роста микробов и / или патогенеза, хотя немногие из существующих противомикробных препаратов используют метаболизм в качестве противоинфекционной мишени. Метаболический дизайн лекарств может быть легким, поскольку природные субстраты служат шаблоном для конкурентных ингибиторов. Поскольку метаболизм часто включает в себя трансформацию высоко заряженных и полярных метаболитов, ингибиторы метаболических ферментов часто используют фосфонатные функциональные группы для взаимодействия с мишенью 9 .К сожалению, отрицательно заряженные фосфонаты легко исключаются из клеточных мембран и часто проявляют плохие лекарственные свойства 10–19 . Новые стратегии, позволяющие эффективно внедрять антиметаболиты, будут способствовать расширению фармацевтического пространства для противомикробных препаратов.

Одним из способов улучшения проницаемости фосфонатных клеток является химическая маскировка нежелательного отрицательного заряда липофильными группами. Эта стратегия (названная продрагированием) может использовать лабильные промоиды, которые удаляются во время абсорбции, распределения или внутриклеточно, чтобы получить исходный фосфонатный антибиотик (Figure 1a) 17–19 .Ранее мы разработали серию антибиотиков MEPicide, в которых ингибиторы биосинтеза фосфонат-изопреноидов модифицированы липофильным промоэлементом пивалоилоксиметила (ПОМ). Пролекарства MEPicide обходят потребность в активном клеточном транспорте, одновременно повышая эффективность соединения против зоонозных стафилококков, S. schleiferi и S. pseudintermedius , а также Plasmodium falciparum и Mycobacterium tuberculosis 11,13,20– 23 .Однако промоторы ПОМ быстро гидролизуются карбоксилэстеразами сыворотки, что ограничивает in vivo эффективность пролекарств ПОМ как стратегию улучшения лекарственно-подобных свойств заряженных антимикробных препаратов 12,24 .

Рисунок 1

Модель активации пролекарства (а) и предполагаемый ферментативный механизм. (b) Промоэфиры карбокси-эфира выделены зеленым цветом.

Чтобы обеспечить эффективную доставку фосфонатных антибиотиков в клетки, необходимы новые липофильные пролекарства, устойчивые к карбоксилэстеразам сыворотки, но расщепляемые микробными эстеразами.Эта стратегия была эффективно использована для достижения тканеспецифической селективной активации пролекарства. Например, нацеленная на печень доставка пролекарства была достигнута за счет использования особой субстратной специфичности печеночно-специфической изоформы P450, CYP3A4 25,26 . Соответственно, понимание ферментативных и структурных механизмов активации микробных пролекарств будет способствовать развитию микроб-специфичных пролекарств.

Недавно мы описали стафилококковый фермент GloB, который облегчает активацию пролекарств сложных эфиров карбокси в S.schleiferi и S. pseudintermedius 27 . Примечательно, что GloB недостаточно для полной активации пролекарств in vitro , что позволяет предположить, что для полного высвобождения фосфонатов необходим по крайней мере один дополнительный фермент. В этой работе мы идентифицируем и охарактеризуем роль двух эстераз S. aureus , GloB и FrmB, каждая из которых катализирует гидролиз пролекарства сложного эфира карбокси и способствует активации пролекарства сложного эфира карбокси. Мы демонстрируем, что обе эстеразы обладают определенной субстратной специфичностью, которая отличается от субстратной специфичности сывороток человека и мыши.Наконец, мы представляем трехмерные структуры GloB и FrmB, чтобы обеспечить непрерывный структурно-ориентированный дизайн пролекарств, нацеленных на FrmB и GloB.

Результаты

Идентификация микробных эстераз, ответственных за активность карбоксилэстеразы

У зоонозных стафилококков S. schleiferi и S. pseudintermedius , потеря фермента GloB, гидроксиацилглутатион-гидролазы, устойчивости к ферментам глиоксалазы II пролекарства сложных эфиров карбокси, поскольку пролекарства сложных эфиров карбокси не активируются 27 .Однако одного очищенного GloB недостаточно для активации пролекарств на основе сложных эфиров карбокси in vitro , что позволяет предположить, что требуется по крайней мере один дополнительный клеточный фермент. Основываясь на предполагаемом пути активации карбокси-эфира, мы предположили, что отсутствующий (е) фермент (ы) может быть либо другой карбоксилэстеразой, либо фосфодиэстеразой (рис. 1b). Чтобы установить путь активации пролекарства сложного карбоксиэфира в S. aureus , мы использовали Библиотеку мутантов транспозонов штата Небраска (NTML), в которой почти 2000 несущественных S.aureus были индивидуально разрушены вставкой стабильного транспозона 28 . Используя функцию генной онтологии на веб-сайте NTML (https://app1.unmc.edu/fgx/gene-ontologies.html), мы идентифицировали шесть гидролаз сложных эфиров карбоновых кислот (включая gloB ), 11 фосфатаз и девять гидролаз сложных диэфиров фосфорной кислоты. в качестве кандидатов в активаторы пролекарств сложных эфиров карбокси (дополнительная таблица 1). Каждый идентифицированный мутант транспозона подвергали скринингу на устойчивость к пролекарству сложного эфира карбокси, POM-HEX.POM-HEX представляет собой пивалоилоксиметильное пролекарство соединения HEX, которое ингибирует гликолитический фермент енолазу (рисунок 1b, рисунок 2a). Из 26 кандидатных мутантов транспозона эстеразы только два штамма были значительно более устойчивыми к POM-HEX, чем родительский штамм S. aureus , JE2 , как было определено по половинной максимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ) (рис. 2b, Дополнительная таблица 1). Один из этих штаммов имел транспозон, разрушающий ген, кодирующий фермент глиоксалазу II, GloB.Ортолог GloB в S. scheiferi представляет собой фермент, активирующий пролекарства, мутация которого придает устойчивость к POM-HEX 27 . Второй устойчивый к POM-HEX штамм содержал вставку транспозона в локус, кодирующий предсказанную карбоксилэстеразу, аннотированный как FrmB. FrmB ранее был идентифицирован как FphF, сериновая гидролаза, и является основной мишенью S. aureus для сульфонилфторидного соединения JCP678 29 . Поскольку активность S -формилглутатионгидролазы, скорее всего, является биологической функцией этого белка, мы будем называть этот белок так, как он был назван в E.coli — FrmB.

Рисунок 2

Прямые и обратные генетические подходы идентифицируют FrmB и GloB в качестве кандидатов на гидролазы POM-пролекарства в S. aureus . (а) Обратная генетическая идентификация кандидатных ферментов, активирующих пролекарства. (b) Чувствительность к POM-HEX идентифицированных генов устойчивости-кандидатов из (a), как определено с помощью IC 50 . (c) Метод прямого генетического скрининга. (d) Чувствительность к POM-HEX устойчивых к POM-HEX S. aureus . (e) Несинонимичные точечные мутации, идентифицированные с помощью полногеномного секвенирования в frmB и gloB .Во всех экспериментах GloB окрашен в зеленый цвет, а FrmB — в оранжевый. Показаны средства трех независимых биологических экспериментов.

Параллельно мы использовали беспристрастный подход прямой генетики для выявления генетических изменений, связанных с устойчивостью к POM-HEX. Стафилококки, устойчивые к POM-HEX, были получены путем воздействия POM-HEX на концентрацию POM-HEX S. aureus Newman дикого типа (WT). Всего было отобрано и клонировано 25 изолятов со значениями IC 50 в диапазоне от 1.В 5-16 раз больше, чем у WT S. aureus Newman (рис. 2 c, d, дополнительная таблица 2). Полногеномное секвенирование штаммов, устойчивых к POM-HEX, выявило мутации в frmB (n = 7), gloB (n = 10) и штаммы без мутаций в frmB или gloB (n = 8) . Большинство мутаций были несинонимичными однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) (рисунок 2d, дополнительная таблица 2). В трех случаях gloB было единственным подтвержденным генетическим изменением в геноме.Кроме того, каждый из frmB и gloB имел по одному экземпляру мутации, приводящей к преждевременному усечению стоп-кодоном белка до менее чем 100 аминокислотной последовательности. Штаммы без идентифицированных мутаций ни в frmB , ни в gloB не имели каких-либо мутаций, которые сразу же очевидны как механизмы устойчивости к POM-HEX. Из мутаций не- frmB и не- gloB мы выбрали мутанты транспозонов из NTML, которые имели вставки транспозонов в соответствующие гены.Эти мутации транспозонов не придавали устойчивости к POM-HEX (дополнительная таблица 3). В подавляющем большинстве случаев предполагается, что наблюдаемые мутации в frmB и gloB оказывают пагубное влияние на функцию белка (оценка PROVEAN ниже порогового значения -2,5) (рис. 2e).

Чтобы оценить сохранность последовательности FrmB и GloB среди S. aureus , мы выполнили анализ WhatsGNU для всех общедоступных геномов S. aureus . WhatsGNU — это биоинформатический инструмент, который может сжимать большие базы данных и оценивать количество случаев, когда конкретный ген имеет 100% покрытие последовательности и идентичность во всей базе данных 30 .Этот параметр, оценка единицы новизны гена (GNU), является высоким, когда последовательность находится под сильным селективным давлением в популяции, и низким, когда ген является вариабельным. GloB показывает исключительно высокий балл GNU 8215 (из возможных 10350), что указывает на сильную консервацию последовательностей для S . aureus GloB. Напротив, последовательности FrmB, по-видимому, чрезвычайно консервативны в пределах индивидуальных клональных комплексов S. aureus , но варьируются между каждым комплексом (баллы GNU 2218 или 3370 из 10350, дополнительная фигура 1).Мы построили филогенетическое дерево ортологов GloB и FrmB среди микробных популяций. Большинство видов бактерий содержат ортолог GloB, хотя первичная последовательность сильно варьирует у разных видов и не легко группируется в соответствии с древом жизни (дополнительный рисунок 2). Последовательности FrmB также сильно расходятся в последовательностях, хотя они имеют тенденцию группироваться ближе к ожидаемому древу жизни (дополнительный рисунок 2).

Согласие между нашими прямым и обратным генетическим скринингом убедительно свидетельствует о том, что две дискретные предсказанные эстеразы, а не пул избыточных клеточных эстераз активируют пролекарство в S.aureus . Кроме того, обнаружение того факта, что мутации либо в frmB , либо в gloB достаточно для придания устойчивости к POM-HEX, предполагает, что два фермента могут работать совместно, чтобы биоконвертировать POM-HEX в HEX. Поскольку между frmB и gloB происходит существенная вариация последовательности, любые пролекарственные средства, которые захватывают эти два фермента, могут не активироваться в широком масштабе у всех бактерий.

FrmB и GloB представляют собой карбоксилэстеразы с расходящейся субстратной специфичностью.

GloB, как предполагается, является глиоксалазой типа II и членом большого суперсемейства белков металло-β-лактамаз (INTERPRO IPR001279).Ферменты глиоксалазы II, включая близкородственный ортолог GloB из S. scheiferi , катализируют вторую стадию пути глиоксалазы, который отвечает за клеточное превращение метилглиоксаля (токсичный побочный продукт гликолиза) в молочную кислоту 27,31–33 . Напротив, ортологи FrmB гидролизуют п-нитрофениловые эфиры короткоцепочечных жирных кислот (C2-C6) и, как полагают, опосредуют детоксикацию клеточного формальдегида 34,35 .

Мы очистили рекомбинантный WT Sa, FrmB и Sa, GloB, чтобы оценить ферментативную функцию каждого белка (дополнительный рисунок 3a).Сначала мы оценили активность глиоксалазы II с помощью анализа, который сочетает гидролиз субстрата глиоксалазы II, S -лактоилглутатион, с изменением оптической плотности (дополнительный рисунок 3b). Sa GloB гидролизует S -лактоилглутатион с удельной активностью, сравнимой с ранее охарактеризованными микробными глиоксалазами типа II, но Sa FrmB не обладает заметной глиоксалазной активностью.

Затем мы оценили способность FrmB и GloB гидролизовать п-нитрофениловые эфиры короткоцепочечных жирных кислот, которые имеют фотометрические изменения при гидролизе (дополнительный рисунок 3c).FrmB обладает умеренной активностью против 4-нитрофенилацетата и бутирата, но не активен против 4-нитрофенилтриметилацетата, что свидетельствует о предпочтении неразветвленных жирных кислот (дополнительный рисунок 3c). Это открытие согласуется с предыдущей характеристикой FrmB как имеющего предпочтение короткоцепочечных и неразветвленных гидрофобных липидных субстратов 35 . Примечательно, что GloB не проявляет заметной активности против этих субстратов, и ни GloB, ни FrmB не гидролизуют 4-нитрофенилтриметилацетат, несмотря на его структурное сходство с POM-HEX.Это может быть связано с отсутствием фрагмента ацилоксиметилового эфира в 4-нитрофенильных субстратах, который обнаруживается в пролекарствах ПОМ.

Мы также стремились напрямую оценить роль GloB и FrmB в активации POM-HEX. Мы инкубировали каждый фермент с POM-HEX и охарактеризовали продукты с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 31 P- 1 H-гетероядерной одноканальной когерентности (HSQC). Ранее мы показали, что GloB удаляет только один фрагмент ПОМ, что приводит к накоплению моно-ПОМ-HEX (рис. 1b) 27 .Точно так же FrmB способен удалять только одну часть POM (дополнительный рисунок 4). Мы предположили, что две эстеразы могут быть стереоселективными, и инкубировали оба фермента с POM-HEX. Мы обнаружили, что инкубация POM-HEX с GloB и FrmB все еще приводит к накоплению моно-POM-HEX, предполагая, что две эстеразы могут быть неспособны расщеплять заряженные частицы моно-POM (дополнительный рисунок 4).

Субстратная специфичность GloB и FrmB

Чтобы облегчить разработку микробиологической активации пролекарства с использованием этих двух ферментов, мы затем попытались всесторонне охарактеризовать субстратную специфичность GloB и FrmB.Мы использовали 32-компонентную библиотеку субстратов сложных эфиров, которая флуоресцирует в зависимости от активности эстеразы (дополнительный рисунок 5) 36 . Эта библиотека систематически изменяет длину сложноэфирного субстрата, паттерны разветвления и расположение эфира и сульфида, что позволяет точно определять взаимосвязь структура-активность. Кинетические измерения были выполнены как для FrmB, так и для GloB в диапазоне концентраций субстрата для всей библиотеки, что позволило рассчитать каталитическую эффективность ( k cat / K m ) для каждого фермента и субстрата (дополнительные таблицы S4, S5).

Мы обнаружили, что FrmB и GloB имеют тенденцию иметь самую высокую активность по отношению к эфирам кислорода (дополнительные рисунки 5 и 6). GloB обладает наивысшей активностью против короткоцепочечных эфиров (соединения 1-3), с некоторой толерантностью к разветвлению у первого атома углерода за пределами карбонила сложного эфира (соединения 7-9), в то время как обширное разветвление сильно снижает активность (соединение 10). Примечательно, что GloB толерантен к чрезмерному стерическому объему, введенному с субстратом феноксиуксусной кислоты, если субстрат содержит кислород или простой эфир серы (серия соединений 11).GloB проявляет сильное предпочтение к кислороду в β-положении по сравнению с карбонилом по сравнению с γ-положением, но безразличен к расположению серы. В то время как GloB имеет более широкий диапазон каталитической специфичности, FrmB демонстрирует более низкую общую активность и более узкий диапазон каталитической эффективности. FrmB гидролизует неразветвленные субстраты без особого внимания к длине цепи или объему конца цепи в тестируемых субстратах (соединения серии 1-3, 11). Разветвление в положении после карбонила сложного эфира (соединения серии 7-9, 12) вредно для активности FrmB.Когда в цепь включен кислород, расположение в β-положении по отношению к карбонилу значительно предпочтительнее, чем γ-положение. Как для GloB, так и для FrmB расширение библиотеки тестируемых субстратов будет раскрывать истинные ограничения ферментативной активности.

Важность субстратной специфичности

in vivo

Хотя профиль ферментативного субстрата in vitro является информативным для того, как отдельные ферменты активируют пролекарства, он может не отражать сложные биохимические процессы, происходящие in vivo , где дополнительные клеточные эстеразы могут влиять в целом составная активация.Мы выполнили количественную визуализацию живых клеток, чтобы измерить активацию профлуоресцентных субстратов в режиме реального времени. Мы загрузили S. aureus на микрофлюидное устройство и визуализировали клетки с помощью фазово-контрастной и эпифлуоресцентной микроскопии до и во время подачи профлюоресцентного соединения. Внутриклеточная флуоресценция накапливается в ответ на быстрое введение субстрата в камеру и может быть количественно определена с течением времени.

Мы выбрали четыре профлуоресцентных субстрата с различной каталитической эффективностью против FrmB и GloB для тестирования в наших микрофлюидных экспериментах. In vitro , s ubstrate 1O демонстрирует высокую активность как для FrmB, так и для GloB, 3C демонстрирует умеренную активность для FrmB и GloB, 5O имеет умеренную активность против GloB, но низкую активность против FrmB, а 9C имеет низкую активность против GloB и FrmB. (Дополнительные рисунки 5 и 6). Сравнивая активацию этих субстратов во времени, мы обнаруживаем, что наше определение каталитической эффективности in vitro хорошо коррелирует с нашими темпами внутриклеточной активации (рис. 3, дополнительные видеоролики 1–4).Соединение 10, которое демонстрирует высокую каталитическую эффективность как с GloB, так и с FrmB, достигает насыщения флуоресценции до первой 2-минутной временной точки. Соединение 3C, которое GloB и FrmB используют с умеренной активностью, медленно активируется в течение всего эксперимента, а 5O и 9C, которые имеют обмен от умеренного до плохого как с GloB, так и с FrmB, никогда существенно не активируются в течение 30 минут наблюдения ( Рисунок 3). Поскольку флуоресцентная активация количественно определяется для каждой отдельной клетки, мы также можем оценить однородность активации пролекарства в популяции.Мы наблюдаем удивительно однородную активацию пролекарств во всех наблюдаемых клетках (рис. 3).

Рисунок 3

Скорость активации in vivo зависит от выбора промо-группы сложного эфира. Временной ряд активации различных флуорогенных субстратов (дополнительный рисунок 5). Субстраты добавляли в микрофлюидную камеру при t = 10 минут. Справа — количественная оценка флуоресценции отдельных клеток или кластеров клеток на площади. Слабые следы представляют собой отдельные клетки, а более темные следы представляют собой среднее значение данного эксперимента.Каждый эксперимент проводился в биологическом дубликате, и каждый эксперимент отображался разным цветом (пурпурным или зеленым). Планки ошибок обозначают SD.

Трехмерная структура FrmB

Чтобы установить структурную основу для субстратной специфичности FrmB и GloB и сделать возможным будущий структурно-ориентированный терапевтический дизайн пролекарств, мы решили трехмерные структуры обоих i> S. aureus FrmB и GloB. S. aureus FrmB был расшифрован при 1,60 Å с использованием молекулярного замещения низкотемпературной активной щелочной эстеразой Est12 (PDB ID: 4RGY) в качестве модели поиска 37 .Параметры уточнения и статистика суммированы в дополнительной таблице 6. Один димер FrmB наблюдается в асимметричной единице, что соответствует кажущейся молекулярной массе FrmB, наблюдаемой с помощью эксклюзионной хроматографии. Общая складка FrmB характерна для складки α / β-гидролазы. Шесть параллельных β-цепей и одна пара антипараллельных β-цепей образуют центральный восьмицепочечный β-лист, окруженный α-спиралями (рис. 4a). Один мономер FrmB имеет электронную плотность для одного иона магния, тогда как второй мономер содержит два иона магния.

Рисунок 4

Трехмерная структура FrmB. (а) Общая складка, α-спирали, окрашенные в оранжевый цвет, и β-тяжи, окрашенные в фиолетовый цвет. (b) Сравнение между Sa FrmB (оранжевый) и его ближайшим человеческим ортологом, ESTD (серый). Остатки активного центра обозначены оранжевыми сферами. (c, d) Докинг субстрата 10 (палочки) в активном центре FrmB. красный цвет указывает на высокогидрофобные и белые гидрофильные остатки. Вид поверхности (c) или вид ручки с каталитической триадой (d).

Поиск структурного сходства был выполнен с использованием сервера DALI для идентификации белков, связанных с Sa FrmB.Структура Sa FrmB была наиболее похожа на модель молекулярного замещения Est12 из глубоководных бактерий (PDB ID 4RGY, среднеквадратичное отклонение (rmsd) = 1,020 Å), но также имела сходство с эстеразой феруловой кислоты Bacteroides Кишечник . Bi Fae1A (PDB ID 5VOL, rmsd = 1,137 Å) и Streptococcus pneumonia трибутиринэстераза estA (PDB ID 2UZ0, rmsd = 1,329 Å) 38-40 . Все структуры демонстрируют сильную структурную консервативность, включая расположение прототипной каталитической триады серингидролазы: Ser120, Asp204 и His233 ( S.aureus ) (дополнительный рисунок 7). Наиболее разительное различие между родственными структурами — это гибкий кэп-домен, участвующий в субстратной специфичности EstA и Est12 37,40 . Пока эта рукопись находилась в стадии подготовки, было сообщено о независимой структуре FrmB 35 . Две структуры почти идентичны (PDB ID 6ZHD, среднеквадратичное значение d = 0,433 Å), с немного разным расположением покрывающего домена.

Мы сравнили Sa FrmB с его ближайшим человеческим ортологом, человеческой эстеразой D (PDB ID 3fcx), обнаружив умеренное структурное сходство как в целом (r.m.s.d = 4,625 Å) и в расположении каталитической триады 41 . Однако Sa, FrmB и человеческая эстераза D заметно различаются по доступной для растворителя поверхности вокруг активного сайта, что указывает на возможность использования различных субстратов, в первую очередь за счет дифференциального позиционирования кэп-домена (рис. 4b).

Используя Autodock Vina, мы смоделировали субстрат FrmB, 1O с наивысшей каталитической эффективностью, на активный центр FrmB 42,43 . Сериновые гидролазы обычно связывают карбонильный кислород субстрата в оксианионной дыре, и гидролиз субстрата инициируется через атаку каталитического серина на карбонил сложного эфира.Закрепление 10 на FrmB имитирует начальное состояние реакции серингидролазы, при этом карбонильный кислород захоронен, а каталитический серин готов к атаке (рис. 4с). Карман непосредственно рядом с отверстием для оксианиона относительно узкий, это указывает на то, что стерические препятствия объясняют слабую активность FrmB против разветвленных субстратов. Карман активного центра расширяется и значительно открывается после прохождения через оксианионное отверстие, поддерживая способность FrmB гидролизовать субстраты, которые содержат большие стерические группы, удаленные от углерода карбонила, такие как 110.

Трехмерная структура GloB

Мы также решили структуру Sa GloB до 1,65 Å, используя селенометионин (SeMet) -замещенный GloB и молекулярную замену с использованием металло-β-лактамазы TTHA1623 из Thermus thermophilus в качестве поиска. модель 44 . Окончательные параметры уточнения структуры и статистические данные приведены в дополнительной таблице 6. Четыре мономера Sa GloB наблюдаются в асимметричном звене, каждый из которых демонстрирует кристаллографическую симметрию. Sa GloB демонстрирует классическую αβ / βα-складку, которая определяет металло-β-лактамазы, включая глиоксалазу II (рис. 5a). 32,44–46 .

Как и в случае с Sa FrmB, поиск на сервере DALI был выполнен для идентификации белков, структурно похожих на Sa GloB. Sa GloB демонстрирует чрезвычайно высокое сходство с необычной глиоксалазой типа II YcbI из Salmonella enterica (PDB ID: 2XF4, rmsd = 0,898 Å), поисковой моделью молекулярной замены TTHA1623 из Thermus thermophilus (PDB ID: 2ZWR, r .m.s.d. = 0,767) и Arabidopsis thaliana глиоксалазы II (PDB ID: 1XM8, rmsd = 1,165 Å), за исключением того, что At GloB имеет 50-аминокислотное С-концевое удлинение (дополнительный рисунок 8a) 32, 44,47 . Также в соответствии с ранее наблюдаемыми структурами GloB, Sa GloB показывает четкую электронную плотность для двух ионов цинка, координированных шестью гистидинами и двумя аспартатами (дополнительный рисунок 8b). Плотность молекулы воды также видна и, по-видимому, координируется двумя ионами цинка, как это наблюдается для глиоксалазы II человека 45 .

Наложение S. aureus GloB на Homo sapiens GloB (PDB: 1qh5) показывает, что эти две структуры очень похожи (среднеквадратичное значение d = 1,249 Å), за некоторыми заметными исключениями. Hs GloB имеет два расширения: одно — вставка из 34 аминокислот; другой — С-концевое удлинение из 32 аминокислот, оба из которых образуют α-спиральные элементы, которые примыкают к активному сайту (Рис. 5b). 45 . На противоположной стороне активного центра Sa GloB имеет гибкую петлю из 19 аминокислот, которая частично наблюдается в электронной плотности.Эта петля расположена так, что она может покрывать активный сайт, стерически затрудняя доступ к субстрату (рис. 5b). В целом, эти структурные различия между Hs GloB и Sa GloB поддерживают дизайн субстратов пролекарств, избирательно расщепляемых S. aureus .

Рисунок 5

Трехмерная структура GloB. (а) Общая складка, α-альфа-спирали, окрашенные в зеленый цвет, и β-тяжи, окрашенные в фиолетовый цвет. (b) Сравнение Sa, GloB (зеленый) и человека GloB (серый).(c) Стыковка субстрата 10 (палочки) в активном центре GloB. Слева, частичный вид карикатуры, вид правой поверхности. Белый цвет представляет собой гидрофильные остатки, тогда как красный цвет представляет собой гидрофобные остатки. Ионы Zn обозначены как серебряные сферы; вода обозначена синей сферой.

Мы смоделировали подложку с наивысшей каталитической эффективностью для GloB, 1O, на нашу структуру. Autodock размещает 1O с карбонильным кислородом рядом с водой активной площадки (рис. 5c) 42,43 . Канал активного сайта GloB кажется умеренно широким, что объясняет, почему сильно разветвленные субстраты не допускаются.Ближе к концу канала активного сайта GloB, кажется, формирует туннель. В этот туннель не попадает субстрат 10, но, вероятно, он будет занят в более стерически объемных субстратах, таких как 110. Одно плечо этого туннеля состоит из очень гибкой петли, которая только частично видна в нашей электронной плотности, предполагая, что во время катализа эта гибкая петля может вмещать более крупные субстраты, такие как 110.

Эстеразная специфичность сывороток человека и мыши

Мы стремились оценить, можно ли сконструировать сложноэфирные промоторы для специфической активации микробов.Используя ту же библиотеку флуоресцентных субстратов из 32 соединений, мы определили период полужизни каждого субстрата в сыворотке. Функции восстановленной и свежей сыворотки сопоставимы по активности и предпочтениям в отношении субстрата (дополнительный рисунок 9).

Мы выполнили полное кинетическое профилирование лиофилизированной сыворотки человека, чтобы определить специфичность ее сложноэфирного субстрата. Поскольку сыворотка представляет собой смесь нескольких белков вместо одного вида белка, мы сообщаем о V max / K m , нормированном на общее количество белка, добавленного в анализ (дополнительный рисунок 10A).Как наблюдалось для FrmB и GloB (дополнительные рисунки 10b, c), сыворотка человека имеет наивысшую активность по отношению к соединениям кислорода и серного эфира. В отличие от FrmB и GloB, человеческая сыворотка относительно однородна по своей эстеразной активности в библиотеке субстратов. Короткоцепочечные субстраты демонстрируют наивысшую каталитическую эффективность, и, хотя разветвление немного снижает эффективность, оно не оказывает такого сильного воздействия, как это наблюдалось с FrmB. Подложки, демонстрирующие наименьшую каталитическую эффективность, обычно представляют собой углеродный ряд, в котором добавленное разветвление приводит к снижению использования субстрата.

Поскольку мышиные модели часто используются при разработке и тестировании новых фармацевтических препаратов, мы также охарактеризовали субстратные предпочтения сывороток мышей. Примечательно, что мыши хорошо известны своей чрезвычайно активной и широкой активностью сывороточной эстеразы. Действительно, мы обнаружили, что сыворотка мыши демонстрирует примерно в 100 раз более высокую активность на 1 мг сывороточного белка, чем сыворотка человека (дополнительный рисунок 10d, 11). Это увеличение активности неоднородно по библиотеке субстратов. Сыворотки человека не так активны по отношению к ряду углерода и сравнительно лучше реагируют на соединения кислорода и серного эфира (дополнительный рисунок 11b).Таким образом, наши данные предполагают, что сыворотка мышей плохо предсказывает стабильность сложноэфирных пролекарств в сыворотке крови человека.

Наконец, мы попытались оценить, можно ли использовать специфичность субстратов GloB и FrmB для создания пролекарств, нацеленных на микробов. Поскольку каждая эстераза может встретить несколько потенциальных субстратов in vivo , мы использовали наш модифицированный V max / K m в качестве компаратора. Мы выполнили попарный анализ для каждой комбинации FrmB и GloB в отношении сыворотки крови человека и мыши (рис. 6a-d).Используя пороговое значение в 2 10 -кратного обогащения активности микробных ферментов над ферментами сыворотки, FrmB демонстрирует предпочтение перед сывороткой человека для двух соединений-3C и 6C, тогда как GloB демонстрирует предпочтение шести соединениям-2S, 3C, 10C, 11C, 11O и 11S (рисунок 6e). И наоборот, мышиные сыворотки гидролизуют все соединения в пределах этого порогового значения. При снижении порогового значения до 2 5 -кратного обогащения каталитической эффективности по сравнению с сывороткой мыши, FrmB и GloB являются более специфичными для соединения 2S, а GloB дополнительно демонстрирует специфичность для соединения 11O.

Рисунок 6

Сравнение каталитической эффективности микробной эстеразы и сывороточной эстеразы. (a-d) Графики каталитической эффективности вулканов. Показаны средства трех независимых экспериментов. P-значения рассчитываются как попарные t-критерии с поправкой Холма-Сидака для множественных сравнений. (a) Сравнение сыворотки человека и GloB, (b) сыворотки человека и FrmB, (c) сыворотки мыши и GloB, и (d) сыворотки мыши и FrmB). (e) Структуры сложноэфирных субстратов с обогащением 2 10 по каталитической эффективности микробных эстераз по сравнению с сывороткой человека (слева) или с обогащением 2 5 по сравнению с сывороткой мыши.Пунктирная линия указывает значение p 0,05.

Методы

Материалы

POM-HEX, Hemi-HEX и HEX были синтезированы и ресуспендированы в 100% DMSO, как описано ранее 12 . Флуоресцентные сложноэфирные соединения были щедро предоставлены лабораторией Джеффри Хупса (Университет Батлера), и синтез и характеристика были ранее описаны 36 . Объединенные, делипидированные, дефибринированные и лиофилизированные сыворотки человека и мыши были получены от Rockland Inc.

Количественная оценка устойчивости

Определение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ) проводили с использованием разбавления микротитровального бульона в прозрачных 96-луночных планшетах 48 . Вкратце, POM-HEX добавляли к 75 мкл среды LB с конечной концентрацией 20-50 мкМ POM-HEX и 0,5% ДМСО, причем концентрации POM-HEX менялись в зависимости от устойчивого штамма. Затем POM-HEX серийно разводили в среде LB, содержащей 0,5% ДМСО, всего в 10 разведениях. Две лунки оставили без лекарственного средства, одну использовали для определения 100% роста, а другую использовали для контроля загрязнения среды и определения роста 0%.Затем в планшет добавляли 75 мкл средней логарифмической фазы S. aureus , разведенной до 1 × 10 5 колониеобразующих единиц / мл. После инокуляции планшеты инкубировали при 37 ° C при встряхивании, и измерения OD 600 проводили каждые 20 минут в течение всего 16 часов. Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC 50 ) определяли путем подгонки OD 600 каждого условия после 10 часов роста к нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.Эксперименты проводили в трех повторностях с техническими дубликатами.

Генерирование штаммов, устойчивых к POM-HEX

, осуществляли путем высевания log-фазы S. aureus Newman на агар LB, содержащего 3,33 мкМ POM-HEX, и инкубации при 37 ° C в течение ночи. Выжившие одиночные колонии выращивали в течение ночи в среде LB и замораживали в 10% глицерине для длительного хранения. Все анализы были выполнены из свежих инокуляций в течение ночи из запасов глицерина.

Секвенирование всего генома и обнаружение вариантов

Целостность геномной ДНК определяли с помощью Agilent 4200 Tapestation.Для подготовки библиотеки использовалось 0,25-0,5 мкг ДНК. ДНК фрагментировали с использованием ультразвукового аппарата Covaris E220 с использованием пиковой падающей мощности 175, коэффициента заполнения 10%, циклов на пакет 200 в течение 240 секунд при 4 ° C. У ДНК были тупые концы, к 3 ’концам было добавлено основание A, а затем к концам были лигированы адаптеры секвенирования Illumina. Затем лигированные фрагменты амплифицировали в течение 9 циклов с использованием праймеров, включающих уникальные метки с двойным индексом. Фрагменты секвенировали на Illumina MiSeq с использованием считывания парных концов на 150 оснований.

Для анализа собранная WT геномная последовательность для S. aureus Newman была получена из GenBank (номер доступа AP009351.1), и считывания парных концов были сопоставлены с этим геномом с использованием Novoalign v3.03 (Novocraft Technologies ). Дубликаты были удалены, а варианты были вызваны с помощью SAMtools 49 . SNP были отфильтрованы против секвенированного родительского штамма, а генетические варианты были аннотированы с помощью SnpEff v4.3 50 . Данные о секвенировании всего генома доступны в базе данных NCBI BioProject и в архиве чтения последовательностей под идентификатором BioProject PRJNA648156.Все идентифицированные варианты были проверены секвенированием по Сэнгеру с использованием специфичных для генов праймеров, указанных в дополнительной таблице 9. Ампликоны были секвенированы GeneWiz Inc (Пекин, Китай).

Рекомбинантная экспрессия и очистка FrmB и GloB

WT Последовательности frmB и gloB из S. aureus Newman были клонированы в вектор BG1861 компанией GeneWiz Inc для введения гексагистидиновой метки 51 . Полученные плазмиды трансформировали в химически компетентные клетки Stellar (Clontech Laboratories), отбирали карбенициллином, и последовательность подтверждали секвенированием по Сэнгеру.Впоследствии плазмиды трансформировали в химически компетентные клетки BL21 (DE3) и отбирали с помощью ампициллина 50 мкг / мл. Ночные жидкие культуры разбавляли 1: 500 в среде LB с добавлением ампициллина, выращивали при встряхивании при 220 об / мин до OD 600 0,5-0,8 при 37 ° C, охлаждали до 16 ° C и индуцировали 0,5 мМ изопропил-β-D- 1-тиогалактопиранозид (IPTG) в течение 16-20 часов. Клетки собирали центрифугированием при 6000 g в течение 10 минут при 4 ° C. Осадок клеток лизировали ультразвуком в 50 мл буфера для лизиса, содержащего 25 мМ Tris HCl (pH 7.5), 250 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ MgCl 2 , 10% глицерина и 200 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Остатки клеток удаляли центрифугированием дважды при 20000 x g в течение 20 мин. Белки, меченные гексагистидином, очищали аффинно из растворимого лизата с использованием гранул никелевой агарозы (Gold Biotechnology). Связанный белок промывали 50 мл буфера для лизиса перед элюированием с использованием 5 мл буфера для элюирования, содержащего 25 мМ Tris HCl pH 7,5, 250 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, 1 мМ MgCl 2 , 10% глицерин.Аффинно очищенный белок дополнительно очищали на гель-фильтрационной колонке HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthsciences) с использованием AKTA Explorer. Буфер FPLC содержал 25 мМ Трис HCl pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 и 10% глицерина. Фракции, содержащие белок> 90% чистоты (оценка с помощью SDS-PAGE), концентрировали с использованием центрифужного устройства Amicon Ultra-15 (EMD Millipore) и мгновенно замораживали в жидком азоте перед хранением при -80 ° C.

Белок, использованный во время экспериментов по кристаллографии, был получен с помощью тех же последовательностей frmB и gloB , но экспрессия осуществлялась из вектора pET28a. frmB был клонирован в вектор pET28a компанией GeneWiz Inc (Пекин, Китай), а gloB был клонирован из вектора BG1861 с использованием прямого праймера 5’-dTGCTCGAGTGCGGCCGCTTAACCGTGTAAAAATGGATTT3 ’-CTGATGACT3’ и обратного праймера 5’-dCGACTAGACTGATGATGACTAGACT и обратного праймера 5’-dCGACTAG. Продукт ПЦР клонировали в pET28a, расщепленную рестрикционными ферментами NotI и NdeI, с использованием InFusion HD Cloning (Takara Bio). Обе стратегии клонирования вводят гексагистидиновую метку, за которой следует последовательность расщепления тромбином.Плазмиды pET28a, кодирующие либо frmB, либо gloB, трансформировали в химически компетентные клетки E.coli BL21 (DE3). Экспрессия белка FrmB происходила, как описано ранее, за исключением того, что клетки, содержащие FrmB, выращивали в среде Terrific Broth (24 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л триптона, 4 мл / л глицерина, 17 мМ KH 2 PO 4 , 72 мМ K 2 HPO 4 ).

GloB, меченный селенометионином (SeMet), получали согласно Van Duyne et al. с небольшими доработками 52 .Вкратце, ночные культуры выращивали в среде LB, промывали и ресуспендировали в минимальной среде M9 (на литр: 64 г Na 2 HPO 4 , 15 г KH 2 PO 4 , 2,5 г NaCl и 5 г NH 4 Cl) с добавлением 50 мг ЭДТА, 8 мг FeCl 3 , 0,5 мг ZnCl 2 , 0,1 мг CuCl 2 , 0,1 мг CoCl 2 , 0,1 мг H 3 BO 3 , 16 мг MnCl 2 , 0,1 мг Ni 2 SO 4 , 0,1 мг молибденовой кислоты, 0.5 мг рибофлавина, 0,5 мг ниацинамида, 0,5 мг моногидрата пиридоксина и 0,5 мг тиамина на литр. Ресуспендированные культуры выращивали в течение ночи. На следующий день культуры снова разбавляли 1:50 и выращивали до OD 600 0,5-0,8 при 37 ° C. После достижения соответствующей OD 600 нм в культуральную среду добавляли следующие аминокислоты в концентрации: 100 мг / л: лизин, фенилаланин и треонин, 50 мг / л: изолейцин, лейцин и валин, 60 мг / л. : SeMet. Культуры выращивали в течение дополнительных 15 минут при 37 ° C перед тем, как клетки охлаждали до 16 ° C и индуцировали 0.5 мМ IPTG в течение 16-20 часов.

Очистка белка FrmB и SeMet-меченного GloB для кристаллографии выполнялась, как и ранее, за исключением того, что после аффинной очистки элюцию подвергали диализу в течение 16-20 часов при 4 ° C с 20 ед. Тромбиновой протеазой (GE Healthsciences) для удаления гексагистидиновой метки. Буфер для диализа содержал 50 мМ Трис pH 7,5, 50 мМ NaCl и 1 мМ MgCl 2 . После диализа нерасщепленный белок, гексагистидиновую метку и тромбин удаляли путем пропускания диализованного белка через колонку с бензамидин-сефарозой и никелевой агарозой (GE Healthsciences).Проток через колонку дополнительно очищали на гель-фильтрационной колонке HiLoad 16/60 Superdex-200 (GE Healthsciences), уравновешенной диализным буфером. Белок концентрировали до 8-10 мг / мл в центрифуге Amicon Ultra-15 и замораживали при -80 ° C.

Свежая человеческая сыворотка

была собрана у добровольного добровольца в необработанных пробирках BD vacutainer (BD, BD366430) (Washington University IRB # 201012782). Цельной крови давали возможность свернуться при комнатной температуре, и агрегаты отделяли от оставшейся сыворотки центрифугированием при 400 x g в течение 8 минут.Сыворотки получали от одного и того же добровольца в двух разных случаях.

Микрожидкостные измерения на

S. aureus

Ночные культуры S. aureus выращивали в среде LB, обратно разбавляли 1: 500 и выращивали до ранней экспоненциальной фазы (OD 600 0,1-0,15), затем промывали в 1X PBS и загружен на бактериальный микрожидкостный планшет CellASIC ONIX2. Перед загрузкой клеток линии микрожидкостных планшетов промывали 1X PBS + 1% DMSO или 10 мкМ флуоресцентного про-субстрата в 1X PBS + 1% DMSO, и планшет предварительно инкубировали при 37 ° C.Микрожидкостную пластину загружали в инвертированный микроскоп Nikon Ti-E (Nikon Instruments, Inc), оснащенный объективом 100x Plan N (NA = 1,45) Ph4, световым двигателем SOLA SE (Lumencor), камерой управления с подогревом (OKO Labs) и Камера ORCA-Flash5.0 sCMOS (Hammamatsu Photonics). Набор фильтров GFP был приобретен у Chroma Technology Corporation. Клетки загружали в камеру до тех пор, пока одно поле зрения не содержало 50-150 клеток или кластеров клеток. После загрузки клеток 1X PBS медленно пропускали через проточную кювету (t = 0), и клетки наблюдали как с помощью фазовой, так и флуоресцентной микроскопии в течение 10 минут, прежде чем проточную среду быстро переключили в течение двух минут на 1X PBS, содержащую 1 % ДМСО и 10 мкМ флуоресцентного просубстрата перед медленным потоком на оставшуюся часть эксперимента.Изображения получали каждые две минуты в течение 44 минут, и все эксперименты проводились при 37 ° C. Время экспозиции фазового контраста поддерживали постоянным на уровне 200 мс, а время экспозиции флуоресцентного канала поддерживали постоянным на уровне 500 мс. Для флуоресцентных изображений усиление оставалось постоянным во всех экспериментах. Захват и анализ изображений выполнялись с использованием программного обеспечения Nikon Elements Advanced Research. Отдельные клетки или кластеры клеток автоматически детектировались во флуоресцентном канале с использованием собственной фоновой флуоресценции каждой клетки.Ручное лечение следовало за автоматическим обнаружением для удаления обломков или клеток, которые не оставались в поле зрения на протяжении всего эксперимента. Интенсивность флуоресценции для каждой отдельной клетки или кластера клеток измеряли в течение всего эксперимента и нормализовали по площади идентифицированной клетки, чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции. Фоновую автофлуоресценцию клеток корректировали путем вычитания средней флуоресценции по всем идентифицированным объектам от t = 0 до t = 10. Каждый эксперимент проводился в двух экземплярах, с более чем 50 отдельными клетками или кластерами, проанализированными в каждом эксперименте.

Кристаллография белков, фазирование и уточнение данных

Кристаллы S. aureus FrmB выращивали при 16 ° C с использованием диффузии паров в 20 мкл висящих капель, содержащих смесь белка 1: 1 (6 мг / мл), и кристаллизации. буфер (0,1 M Tricine pH 7,7, 15% PEG6K, 2,5 M NaCl, 0,125% n -додецил-β-D-глюкозид). Перед сбором данных кристаллы стабилизировали в криопротекторе (маточный раствор с добавлением 20% глицерина) перед мгновенным замораживанием в жидком азоте для сбора данных при 100 К.Кристаллы Se-Met, меченные S. aureus GloB, выращивали при 16 ° C с использованием диффузии пара в 2 мкл висящих капель, содержащих смесь 1: 1 белка (8 мг / мл) и буфера для кристаллизации (0,1 М имидазола, pH 6,9, 0,2 М сульфата аммония, 0,1 М хлорида кальция и 21% ПЭГ 8k). Кристаллы GloB, меченные SeMet, стабилизировали в растворе лунки с добавлением 15% глицерина и мгновенно замораживали в жидком азоте. Все дифракционные изображения были получены на линии 19-ID усовершенствованного источника фотонов Аргоннской национальной лаборатории в Аргоннской национальной лаборатории.HKL3000 использовался для индексации, интеграции и масштабирования наборов данных 53 . Для фазирования исходного набора данных FrmB молекулярная замена была выполнена в PHASER с использованием рентгеновской кристаллической структуры низкотемпературной активной щелочной эстеразы (PDB ID: 4RGY) в качестве модели поиска 37,54 . Меченный SeMet GloB был фазирован с использованием рентгеновской кристаллической структуры TTHA1623 из Thermus thermophilus HB8 (PDB ID: 2ZWR) 44 . Buccaneer использовался для построения как исходных моделей, так и последующих итерационных раундов построения и уточнения моделей с использованием COOT и PHENIX соответственно 55–57 .Статистика сбора и уточнения данных обобщена в дополнительной таблице 6. Координаты атомов и структурные факторы S. aureus FrmB (PDB: 7L0A) и S. aureus GloB (PDB: 7L0B) депонированы в банке данных белков RCSB.

Стыковка подложки

Структуры GloB и FrmB были подготовлены для автоматической стыковки подложки с помощью AutoDock Tools 1.5.7 42 . Металлы и молекулы воды были удалены из кристаллической структуры FrmB, поскольку канонические сериновые гидролазы не используют металл в своем механизме реакции.Растворитель воды в кристаллической структуре GloB был удален, но вода активного центра и сильно скоординированные молекулы цинка остались на месте. Трехмерная структура подложки 10 была создана с помощью ChemDraw3D и подготовлена ​​к стыковке с помощью AutoDock Tools 1.5.7. Стыковка субстрата FrmB и GloB была выполнена с помощью AutoDock Vina 43 .

Педагогические убеждения учителей. Определение и введение в действие, связь со знаниями и производительностью, разработка и изменение

9069-2000 ISBN 9069-26 978-3-8309-7696-7 ) Lektorat 906 связаны с педагогическими убеждениями учителей и их профессиональными знаниями? Как педагогические убеждения учителей влияют на их работу в классе? Меняются ли педагогические убеждения будущих учителей в процессе обучения? Как эти убеждения определяются и применяются в текущих эмпирических исследованиях? Эта работа представляет собой углубленное эмпирическое исследование различных аспектов педагогических убеждений учителей.[…] Материалы охватывают широкий круг вопросов, включая различие между учителями, работающими на рабочем месте, и учителями, работающими до начала работы, анализируя результаты национальных опросов и международных сопоставлений педагогических убеждений учителей, а также используя различные методологии, касающиеся практического применения и измерения. . (DIPF / Orig.)
Название Педагогические убеждения учителей.Определение и введение в действие, связь со знаниями и производительностью, развитие и изменение
Weitere Beteiligte König, Johannes [Hrsg.]
Originalveröffentlichung Münster; Нью-Йорк ; München; Берлин: Waxmann 2012, 207 S.
Документ Volltext (1,027 КБ)
Документы Deutsches Urheberrecht
Schlagwörter (Deutsch) Bildung; Pädagogik; Kompetenz; Wissen; Befragung; Empirische Forschung; Einstellung; Grundschule; Primarbereich; Лерер; Lehramtsstudent; Lehrerausbildung; Fachwissen; Schülerleistung; Sitzen bleiben; Мотивация; Унтеррихт; Фахдидактик; Двуязычие; Математик; Mathematikunterricht; Messung; Технологии; Überzeugung; Berufsausbildung; Professionalisierung; Беруфсваль; Qualität; Technik; Asien; Deutschland; Ирландия; Schweiz; СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ; Westeuropa
Teildisziplin Vergleichende Erziehungswissenschaft
Schulpädagogik
Dokumentart Monographie, Sammelwerk или Erstveröffentlichung 9069-26
Sprache Englisch
Erscheinungsjahr
Begutachtungsstatus 6 (Verlags64 906
Statistik Anzahl der Zugriffe auf dieses Dokument
Prüfsummen Prüfsummenvergleich als Unversehrtheitsnachweis
Bestellmöglichkeit Kaufmöglichkeit prüfen in buchhandel.de
Eintrag erfolgte am 11.11.2020
Empfohlene Zitierung Кениг, Йоханнес [Hrsg.]: Педагогические убеждения учителей. Определение и введение в действие, связи со знаниями и производительностью, развитие и изменение. Мюнстер; Нью-Йорк ; München; Берлин: Waxmann 2012, 207 S.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Можно использовать следующие HTML-теги и атрибуты:
<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong> 

© 2019 МКОУ "СОШ с. Псыншоко"