МКОУ "СОШ с. Псыншоко"

МКОУ "СОШ с. Псыншоко"

Добро пожаловать на наш сайт!

Ст 53 п 6 гпк: ГПК РК 2022 — Гражданский процессуальный кодекс

Статья 53. Третьи лица, которые не заявляют самостоятельных требований относительно предмета спора Раздел I. Общие положения (ст. 1–159) Гражданский процессуальный кодекс Украины (редакция с 15.12.2017 г.) | Нормативна база України

1. Третьи лица, которые не заявляют самостоятельных требований относительно предмета спора, могут вступить в дело на стороне истца или ответчика до окончания подготовительного производства по делу или до начала первого судебного заседания, если дело рассматривается в порядке упрощенного искового производства, в случае когда решение по делу может повлиять на их права или обязанности относительно одной из сторон. Они могут быть привлечены к участию в деле также по заявлению участников дела.

2. Национальное агентство по вопросам предотвращения коррупции может быть привлечено как третье лицо, которое не заявляет самостоятельных требований относительно предмета спора, на стороне истца по делам относительно применения руководителем или работодателем либо создания им угрозы применения негативных мер воздействия к истцу (увольнение, принуждение к увольнению, привлечение к дисциплинарной ответственности, перевод, аттестация, изменение условий труда, отказ в назначении на высшую должность, сокращение заработной платы и т.

п.) в связи с сообщением им или членом его семьи о нарушении требований Закона Украины «О предотвращении коррупции» другим лицом.

3. Если суд при решении вопроса об открытии производства по делу или при подготовке дела к рассмотрению установит, что решение суда может повлиять на права и обязанности лиц, которые не являются стороной по делу, суд привлекает таких лиц к участию в деле как третьих лиц, которые не заявляют самостоятельных требований относительно предмета спора.

4. В заявлениях о привлечении третьих лиц и в заявлениях третьих лиц о вступлении в дело на стороне истца или ответчика указывается, на каких основаниях третьих лиц надлежит привлечь к участию в деле.

5. О привлечении третьих лиц к участию в деле суд выносит определение, в котором указывает, на какие права или обязанности такого лица и каким образом может повлиять решение суда по делу.

6. Третьи лица, которые не заявляют самостоятельных требований, имеют процессуальные права и обязанности, установленные статьей 43 настоящего Кодекса.

7. Вступление в дело третьего лица, которое не заявляет самостоятельных требований относительно предмета спора, не влечет рассмотрение дела сначала.

ГПК РФ. Статья 53. Оформление и подтверждение полномочий представителя

Статья 53. Оформление и подтверждение полномочий представителя

1. Полномочия представителя на ведение дела должны быть выражены в доверенности, выданной и оформленной в соответствии с законом.

2. Доверенности, выдаваемые гражданами, могут быть удостоверены в нотариальном порядке либо организацией, в которой работает или учится доверитель, товариществом собственников жилья, жилищным, жилищно-строительным или иным специализированным потребительским кооперативом, осуществляющим управление многоквартирным домом, управляющей организацией по месту жительства доверителя, администрацией организации социального обслуживания, в которой находится доверитель, а также стационарного лечебного учреждения, в котором доверитель находится на излечении, командиром (начальником) соответствующих воинских части, соединения, учреждения, военной профессиональной образовательной организации, военной образовательной организации высшего образования, если доверенности выдаются военнослужащими, работниками этих части, соединения, учреждения, военной профессиональной образовательной организации, военной образовательной организации высшего образования или членами их семей.

Доверенности лиц, находящихся в местах лишения свободы, удостоверяются начальником соответствующего места лишения свободы.

3. Доверенность от имени организации выдается за подписью ее руководителя или иного уполномоченного на это ее учредительными документами лица, скрепленной печатью этой организации (при наличии печати).

Полномочия руководителей, органов, действующих в пределах полномочий, предоставленных им федеральным законом, иными правовыми актами или учредительными документами, либо представителей организаций, действующих от имени организаций в пределах полномочий, предусмотренных федеральным законом, иным нормативным правовым актом или учредительными документами, подтверждаются представляемыми ими суду документами, удостоверяющими их статус и факт наделения их полномочиями.

4. Полномочия законных представителей подтверждаются представленными суду документами, удостоверяющими их статус и полномочия.

5. Полномочия адвоката на ведение дела в суде удостоверяются ордером, выданным соответствующим адвокатским образованием.

Иные оказывающие юридическую помощь лица представляют суду документы о высшем юридическом образовании или ученой степени по юридической специальности, а также документы, удостоверяющие их полномочия.

6. Полномочия представителя могут быть определены также в устном заявлении, занесенном в протокол судебного заседания, или письменном заявлении доверителя в суде.

ГАИ за вами наблюдает, но вы этого не видите. Как происходит негласный контроль

Этот автомобиль в потоке ничем не выделяется, и только очень внимательный водитель заметит неладное. Речь о негласном патрулировании, в которое мы отправились вместе с инспекторами специального подразделения по обеспечению безопасности дорожного движения Минской области. Получилось почти как в известном фильме: «Ты инспектора ГАИ видишь?» – «Нет». – «А он есть».

«Заметить сложно, только если рассмотреть форму»

Слово «специальное» намекает на то, что функции этого подразделения отличаются от обычных.

«Наша основная задача – обеспечение безопасности дорожного движения и организация беспрепятственного проезда автомобилей специального назначения, – объясняют инспекторы. – Лишь когда выполнение этой функции не требуется в какой-то период времени (смены), мы занимаемся выявлением правонарушений. Упор делаем на тяжкие, но и остальным случаям внимание тоже уделяем. Сегодня, например, одна из задач – выявление людей, торгующих вдоль дорог «незамерзайкой». На первый взгляд кажется, что они безобидны, однако для безопасности дорожного движения, особенно в период плохой видимости дороги, они представляют проблему».

Инспекторы передвигаются на обычном автомобиле без спецсигналов и раскраски, поэтому у некоторых водителей-нарушителей возникает резонный вопрос: а так можно? Сотрудники ГАИ отвечают положительно, поскольку такая форма контроля регламентирована соответствующими приказами.

«Заметить нас в потоке сложно, только если внимательный водитель или пешеход через салон автомобиля рассмотрит форму. Да, все-таки мы в обмундировании. И еще автомобиль оборудован стробоскопами за радиаторной решеткой, а также звуковой и световой сигнализацией – ее можно заметить в задней части салона патрульного авто. Если мы фиксируем нарушение в потоке, то можем включить и то и другое. При необходимости, конечно же», – уточняют инспекторы.

«И то и другое» не заставило себя долго ждать – девушка-водитель в соседнем ряду активно общалась по телефону за рулем. Ей подали сигнал, автомобиль остановился на обочине. Короткая беседа закончилась для водителя устным предупреждением:

«Говорит, что ребенок болеет, врачу нужно было срочно позвонить – такое оправдание. Проверить это, конечно, затруднительно. Главное, что мы отреагировали и отреагировала водитель – перестала нарушать».

«Водитель знает, что так нельзя ездить, но все равно ездит»

Про торгующих «незамерзайкой» вдоль дорог отдельный разговор. Мало того что жидкость неизвестного происхождения с непонятными свойствами, так еще и люди стоят на обочине оживленных трасс, выставив пирамиды из канистр.

На таких продавцов инспекторы составляют протоколы по ст.18.29 КоАП.

Статья 18.29. Повреждение либо загрязнение автомобильной дороги или иного дорожного сооружения

Повреждение, загрязнение либо загромождение автомобильной дороги, полосы отвода, железнодорожного переезда, другого дорожного сооружения или технического средства регулирования дорожного движения, а равно погрузка и выгрузка груза на проезжей части – влекут наложение штрафа в размере от двух до пяти базовых величин.

«Сегодня торгующих «незамерзайкой» не видно, – резюмирует инспектор и подмечает, что это итог работы в предыдущие дни. – Саму жидкость в основном откуда-то из России возят. Нарушители рассказывали, что за 4 рубля покупают канистру, по 7-8 продают. Только вот что продают и с каким химическим составом, они сами не знают. Не нужно лишний раз повторять, что использование в автомобиле таких сомнительных жидкостей весьма опасно».

Пока инспекторы рассказывают о продавцах «незамерзайки», обнаружен еще один нарушитель. С ним тоже провели беседу.

«На автомобиле сзади установлены шторки. Водитель знает, что с ними нельзя ездить, но все равно ездит. Вынес ему предупреждение, и если его с этими шторками в течение года снова остановят, получит штраф».

Сотрудники ГАИ говорят, что обращают внимание и на автомобили с тонировкой:

«К ответственности привлекаем, а иногда выносим предписания, в которых обязуем водителей устранить нарушение – снять тонировку. В предписании указывается срок, в него нужно уложиться и сообщить в ГАИ об исполнении предписания. Не выполнил или не успел – штраф до 20 базовых величин (ст.24.1 КоАП. – Прим. редакции). И это касается не только тонировки, но и других нарушений, когда на автомобиль устанавливают то, что Правилами запрещено».

Во время движения инспекторы проверяют «номера» автомобилей в потоке – для этого в планшете есть вся нужная информация. Таким способом и «бесправников» выявляют, и автомобили без техосмотра или страховки.

«Из салона преследуемой машины что-то выбросили»

В конце нашего выезда задали несколько вопросов инспектору спецподразделения.

– Расскажите о личном отношении к негласному контролю. Не кажется ли вам, что такая деятельность должна быть открытой и гласной?

– Вот смотрите: когда на патрульном авто работаешь со всеми его атрибутами, то водители предупреждают друг друга, фарами моргают или прочее. Не считаю, что это может водителей дисциплинировать, потому что проехал мимо – и дальше нарушаешь. А вот негласное патрулирование заставляет, на мой взгляд, нарушителей одуматься, ведь они после привлечения к ответственности уже знают и понимают прекрасно, что инспектор может быть где-то рядом, хотя его и не видно. Поэтому, думаю, после встречи с инспекторами во время негласного контроля они считают, что лучше не нарушать. Чем не профилактика и дисциплинирование водителей?

– Слышали, что есть такое понятие, как смешанный контроль. Это как?

– Два автомобиля работают во взаимодействии. Допустим, «гражданский», назовем его так, и со спецраскраской и всеми иными атрибутами ГАИ. Например, я, находясь в «обычном» авто, выявил нарушителя скоростного режима и передал эту информацию своим коллегам, которые работают на спецмашине дальше по дороге. Нарушителя останавливают через километр-другой и привлекают к ответственности. Это сочетание негласного и гласного контроля.

– Законодательство предельно строго относится к водителям, привлекаемым по «пьяной» статье. В прошлом году штрафы были ужесточены. Стало ли таких водителей меньше?

– Не считаю. Они как были, так и остались, огромные штрафы не повлияли, хотя, может, только пока. Надеюсь, со временем водители начнут понимать, что за это грозит. Штрафы за управление в пьяном виде и должны быть большими. Как иначе заставить пьяных не садиться за руль?

– А что с техосмотром? Как повлияла отвязка транспортного налога?

– Стало, на мой взгляд, меньше нарушителей без техосмотра. Вспомните, какие очереди на станциях диагностики были. Многие все-таки ТО прошли.

– Есть ли что-то особенно запомнившееся в вашей работе? 

– В январе этого года работал с напарником в составе патруля, один из автомобилей привлек наше внимание. Подал сигнал об остановке, после чего из салона преследуемой машины со стороны пассажира что-то выбросили. Напарника высадил охранять это место, а сам продолжил преследование. Нарушитель остановился в итоге, в салоне у него пассажир. Как выяснилось, из машины выкинули сверток с наркотиками, более килограмма, причем особо опасного психотропного вещества. Вызвали следственно-оперативную группу и передали задержанных.

Наш вердикт

Оставляем экипаж спецподразделения нести службу дальше, смена продолжается без нас. Мы же подведем итоги.

Самым популярным нарушением во время проверки ГАИ были непристегнутые ремни безопасности. Лишь один водитель-нарушитель получил штраф (полбазовой величины), остальные – предупреждения, как устные, так и письменные с освобождением от административной ответственности.

Столкнулись с беззаконием и несправедливостью? Не знаете, у кого спросить совета? У нас работает правовой отдел Автобизнеса.

Контакты для связи: 

  • мобильный телефон/Viber/Telegram/Whatsapp +375 29 703 99 63; 
  • электронная почта [email protected]

Итоги-2021: главные позиции Конституционного суда

Create by: https://theprosepost.com

You are viewing: Итоги-2021: главные позиции Конституционного суда

Иллюстрация: Право. ru/Петр Козлов

В 2021 году Конституционный суд опубликовал 54 постановления. Это абсолютный рекорд. Особое внимание судьи уделили вопросам, связанным с банкротством. Они допустили размен единственного жилья банкрота и подтвердили право субсидиарного должника оспаривать акты о включении требований в реестр. Были и решения для адвокатов. Суд, в частности, разъяснил, как сотрудники СИЗО могут досматривать защитников. Об этих и других важных позициях КС — в нашей подборке.

С каждым годом Конституционный суд получает все меньше обращений. За три квартала этого года их было 8685 против 9802 за аналогичный период в 2020-м и 11 224 — в 2019-м. Но это не помешало КС в уходящем году поставить новый рекорд по количеству принятых постановлений. Всего их было 54.

«В 2021-м, в отличие от 2020-го, среди решений КС не было резонансных политически значимых, поэтому не было и поводов для критики», — дает общую оценку доктор юридических наук Ирина Алебастрова. В уходящем году суд много внимания уделял социально-экономическим правам, а в некоторых решениях даже отстаивал политические права граждан.


Единственное жилье банкрота

Долгое время проблема единственного жилья должника была одной из ключевых в делах о банкротстве граждан. Еще в 2012 году Конституционный суд допустил размен «роскошного» жилья банкрота в пользу кредиторов и предписал изменить законодательство для закрепления такой возможности (Постановление № 11-П/2012). Но поправки так и не внесли, а Верховный суд последовательно отстаивал неприкосновенность единственного жилья, каким бы дорогим оно ни было.

ПрактикаКонституционный суд разрешил продать единственное жилье банкрота

В апреле этого года КС еще раз обратился к этому вопросу. Он вновь подтвердил, что проблему нужно решать на законодательном уровне. Но на этот раз суд расширил свою позицию и прямо допустил возможность размена квартиры в банкротстве, чтобы частью денег погасить долг перед кредиторами, а на другую часть купить более скромное жилье для должника (его может предоставить и кредитор).

При принятии такого решения арбитражный суд должен, в частности, проверить, были ли злоупотребления со стороны должника: возможно, он специально перевел свое имущество под защиту исполнительского иммунитета. А еще ему следует соотнести рыночную стоимость жилья с величиной долга — обратить взыскание можно, только если это поможет удовлетворить «существенную часть» требований кредиторов, подчеркнул КС.

«Субсидиарка» без банкротства

В мае этого года КС разъяснил, как нужно распределять бремя доказывания в спорах о «субсидиарке» без банкротства. Заявительницей выступила Галина Карпук. Она взыскала с компании неустойку за некачественные двери. Правда, получить деньги женщина не успела — общество исключили из ЕГРЮЛ как недействующее. Тогда Карпук попросила привлечь к субсидиарной ответственности экс-директора фирмы и ее бывшего участника. Но суды ей отказали, сочтя, что женщина не доказала недобросовестность с их стороны.

Если возложить бремя доказывания недобросовестности контролирующих лиц на заявителя-физлица, то это приведет к неравенству процессуальных возможностей. Ведь тогда от гражданина потребуются доказательства, о которых он может просто не знать, учитывая его невовлеченность в корпоративные отношения, обратил внимание Конституционный суд. Таким образом, физлицу достаточно подтвердить наличие «просуженного» долга и факт исключения общества из ЕГРЮЛ. При таких обстоятельствах считается, что именно бездействие контролирующих лиц привело к тому, что общество не исполнило свои обязательства перед заявителем. Впрочем, это не мешает ответчику доказать обратное.

Права субсидиарного должника

Если контролирующее должника лицо привлекли к субсидиарной ответственности, оно может оспаривать акты о включении требований в реестр, которые приняли без его участия, указал КС в своем ноябрьском постановлении. Отсутствие такого права, по мнению судей, снизило бы гарантии судебной защиты прав привлеченных к «субсидиарке» и повысило бы риски произвольного определения размера требований.

«Позиция КС расширяет границы правового статуса контролирующего должника лица, позволяет установить справедливый баланс прав и обязанностей участвующих в деле о банкротстве лиц, а потому однозначно заслуживает поддержки», — считает Антон Кравченко из юрфирмы Федеральный рейтинг. группа Банкротство (включая споры) (mid market) группа Арбитражное судопроизводство (средние и малые споры — mid market) Профайл компании По его словам, до постановления КС суды нередко отказывались признавать за субсидиарными должниками такое право на обжалование.

Пассивный управляющий

В июле уходящего года Конституционный суд подтвердил, что несостоятельные граждане вправе оспорить бездействие своих финансовых управляющих, если те не подают исков для взыскания имеющейся задолженности. При этом отказ управляющих от обращения в суд в таком случае, по мнению судей, может быть обоснован только целями процедуры банкротства.

Если же речь идет о деньгах, которые не подлежат включению в конкурсную массу (например, минимальный доход), то должник может самостоятельно взыскать эти деньги в судебном порядке. Такой подход поддерживает баланс интересов и защищает должника, поскольку управляющий обычно не заинтересован во взыскании активов, которые нельзя включить в конкурсную массу, подчеркнул суд.

Восстановление сроков кредитору

Абз. 2 ч. 6 ст. 112 ГПК разрешает в исключительных случаях восстановить срок на подачу кассационной жалобы, но только в пределах одного года после вступления оспариваемого акта в законную силу. А что, если конкурсный кредитор хочет обжаловать решение, на основании которого другой кредитор включился в реестр, но он узнал об этом решении по истечении года с момента вступления его в законную силу?

Суды все равно могут восстановить ему срок на обжалование, указал КС в своем июньском постановлении. Суд устранил недоработки законодателя, который ранее внес изменения в АПК, но не в ГПК, замечает руководитель екатеринбургского офиса юрфирмы «Арбитраж.ру» Артем Комсюков. Тем самым он наконец-то привел практику арбитражных судов и судов общей юрисдикции к одному знаменателю, добавляет Илья Дедковский из Федеральный рейтинг. группа Арбитражное судопроизводство (средние и малые споры — mid market) группа Комплаенс группа Корпоративное право/Слияния и поглощения (mid market) группа Международный арбитраж группа Разрешение споров в судах общей юрисдикции группа Трудовое и миграционное право (включая споры) группа Антимонопольное право (включая споры) группа Банкротство (включая споры) (mid market) группа Интеллектуальная собственность (Консалтинг) группа Интеллектуальная собственность (Регистрация) группа Семейное и наследственное право группа ТМТ (телекоммуникации, медиа и технологии) группа Земельное право/Коммерческая недвижимость/Строительство группа Интеллектуальная собственность (Защита прав и судебные споры) группа Уголовное право Профайл компании .

Индексация присужденных сумм

Если должник долго не исполняет решение суда, то взыскатель может потребовать индексировать присужденную сумму в случаях, когда это предусмотрено законом или договором, говорится в ст. 208 ГПК и ст. 183 АПК. На деле же суды зачастую отказывали в индексации, ссылаясь на отсутствие ФЗ и условия договора, которые ее предусматривали бы.

КС признал такую практику недопустимой. В январе он обязал законодателя внести поправки в ГПК, а в июле — и в АПК. До тех пор он предписал судами в случаях, когда условия и размер индексации не установлены ФЗ или договором, в качестве критерия индексации использовать индекс потребительских цен.

По словам Александры Карабутовой из Региональный рейтинг. группа Семейное и наследственное право группа Арбитражное судопроизводство (крупные споры — high market) группа Корпоративное право/Слияния и поглощения группа Налоговое консультирование и споры группа Банкротство (включая споры) , до постановлений КС индексация ранее присужденных цен была крайне редким механизмом защиты прав взыскателя как в гражданских, так и в арбитражных делах. Причина этому крылась именно в дефектах соответствующих норм ГПК и АПК, считает Карабутова.

Постройка вблизи газопровода

Если постройка возведена с нарушением установленных ограничений (например, вблизи газопровода), суд может обязать ее снести. Но при рассмотрении таких дел судьи должны учитывать, знал или мог ли знать собственник земли, который возвел постройку, об ограничениях.

Если суд установит добросовестность такого лица, то он должен определить, можно ли сохранить постройку. Если это невозможно, тогда уже суду следует разрешить вопрос о ее сносе, но при условии, что добросовестному собственнику предварительно возместят все причиненные убытки, разъяснил КС в своем ноябрьском постановлении.

«В данном случае суд защитил собственников как слабую сторону от возможного произвола со стороны органов власти», — комментирует важность этого решения Алебастрова.

Добросовестный покупатель

Мужчина продал квартиру без согласия бывшей жены, хотя недвижимость находилась в их совместной собственности. Позднее жена через суд разделила имущество, оспорила эту сделку и обратилась с иском к текущему собственнику, попросив истребовать от него 1/2 доли в праве на квартиру.

ПрактикаКС запретил взыскивать долю проданной бывшим мужем квартиры

Бывший супруг, сведений о котором в ЕГРН нет, сам должен позаботиться о сохранении своего права на имущество, например вовремя принять меры по его разделу. Если гражданин этого не сделал, он не может возлагать негативные последствия сделки на добросовестного участника гражданского оборота, который при покупке ориентировался на запись в реестре.

Супруг, который оказался в подобной ситуации, все еще может защитить свои права, но требования он должен предъявлять к своему бывшему партнеру, разъяснил Конституционный суд в июле этого года.

Материнский капитал

Мужчина стал отцом двоих девочек, которых ему родила суррогатная мать. После этого он женился, и его супруга удочерила детей. В такой ситуации оба родителя оказались лишены права на материнский капитал. КС признал это неконституционным. Такая семья воспитывает детей наравне с другими и умаление ее прав на поддержку противоречит Основному закону, указал суд и предписал законодателю внести соответствующие поправки в правовое регулирование.

«Это постановление стало одним из ответов КС на новые вызовы по обеспечению семейных прав в условиях использования вспомогательных репродуктивных технологий», — комментирует Алебастрова. По ее мнению, суд совершенно справедливо решил, что семьи, которые пользовались такими технологиями, имеют равные с другими права на государственную поддержку и нет ни малейшей причины их этой поддержки лишать.

Избрание главы муниципалитета

Представительный орган муниципалитета может установить правило, по которому глава образования избирается не простым большинством голосов, а квалифицированным (например, 2/3). Это не противоречит Основному закону, решил КС. Но в то же время он признал неконституционной практику, когда из-за повышенной «нормы» депутаты никак не могут избрать нового главу и свое кресло сохраняет прежний.

ПрактикаКС признал неконституционной норму закона о выборах глав муниципалитетов

«Такая практика может поставить под сомнение периодическую сменяемость состава органов власти», — подчеркнул суд. Он предписал законодателю в кратчайшие сроки внести изменения в правовое регулирование: либо самому установить правила, позволяющие определить лицо, которое временно возьмет на себя полномочия главы в сложившейся ситуации, либо дать соответствующее право муниципалитетам.

По словам Алебастровой, особенно важно, что в обоснование своей позиции суд сослался на принцип сменяемости власти. «Приверженность КС этому принципу чрезвычайно важна, поскольку в дальнейшем ее можно использовать в спорах, касающихся других уровней власти», — поясняет она.

Серия одиночных пикетов

В мае Конституционный суд признал, что серию одиночных пикетов, которые проходят в разные дни, нельзя рассматривать как одно публичное мероприятие. Следовательно, такие пикеты не требуют предварительного уведомления и их организаторов нельзя привлекать к «административке» за его отсутствие, подчеркнули судьи. «Иной подход явно противоречил здравому смыслу», — комментирует Алебастрова.

Вместе с тем в этом деле КС проверял не нынешнюю редакцию ч. 1.1 ст. 7 закона «О митингах» («Уведомление о проведении публичного мероприятия»), а ту, что действовала до прошлогодних поправок, замечает член Общественной палаты Калининградской области Алексей Елаев. В декабре 2020-го в ч. 1.1 ст. 7 закона «О митингах» внесли изменения, согласно которым суд может признать серию поочередных пикетов с общей целью одним публичным мероприятием. Текущую версию Конституционному суду еще только предстоит оценить, говорит Елаев.

Досмотр в СИЗО

В июле КС разъяснил, как СИЗО может досматривать адвокатов. Если администрация заподозрила, что защитник проносит что-то запрещенное, она может дополнительно «обыскать» его. Но адвокат вправе потребовать, чтобы результаты досмотра зафиксировали письменно. В протоколе также указываются основания и все действия сотрудников СИЗО.

Дополнительный досмотр нужно проводить «с использованием технических средств». В постановлении не говорится, что это должна быть именно видеокамера. Но если записи все-таки есть, хранить их нужно до конца срока, данного на обжалование действий сотрудников СИЗО. В это время адвокат может получить копию видео.

Расходы на адвоката

В сентябре 2021-го КС решил, что ст. 401.6 УПК о повороте к худшему не соответствует Конституции. Эта норма позволяет через сколько угодно лет взыскать с реабилитированного деньги, полученные от государства в качестве компенсации расходов на адвоката, если акт суда пересмотрели в сторону ухудшения положения осужденного. Теперь законодатель должен изменить УПК.

ПрактикаКС запретил снижать компенсацию при реабилитации

В том же постановлении Конституционный суд подтвердил, что после незаконного уголовного преследования государство обязано компенсировать все расходы на адвоката. Государство должно компенсировать любую сумму «в пределах рыночных значений». Единственная возможность снизить размер выплаты — доказать, что требования о возмещении реабилитированный заявил недобросовестно.

КС считает, что после реабилитации государство должно компенсировать любые расходы на адвоката в пределах рыночных значений, объясняет Антон Гусев, советник практики уголовно-правовой защиты бизнеса Федеральный рейтинг. группа Антимонопольное право (включая споры) группа Арбитражное судопроизводство (средние и малые споры — mid market) группа ВЭД/Таможенное право и валютное регулирование группа ГЧП/Инфраструктурные проекты группа Земельное право/Коммерческая недвижимость/Строительство группа Интеллектуальная собственность (Защита прав и судебные споры) группа Интеллектуальная собственность (Консалтинг) группа Международный арбитраж группа Налоговое консультирование и споры (Налоговые споры) группа ТМТ (телекоммуникации, медиа и технологии) группа Транспортное право группа Трудовое и миграционное право (включая споры) группа Цифровая экономика группа Банкротство (включая споры) (high market) группа Комплаенс группа Корпоративное право/Слияния и поглощения (high market) группа Международные судебные разбирательства группа Налоговое консультирование и споры (Налоговое консультирование) группа Природные ресурсы/Энергетика группа Семейное и наследственное право группа Уголовное право группа Фармацевтика и здравоохранение группа Финансовое/Банковское право группа Частный капитал 2место По выручке 2место По выручке на юриста (более 30 юристов) 5место По количеству юристов Профайл компании . Но именно отсылка к рыночным значениям не позволит полноценно реализовать постановление, уверен он. «Непонятно, о каких рыночных значениях говорит КС. О каком рынке адвокатских услуг идет речь: России, региона, города?» — поясняет Гусев.

Затраты потерпевшего

В мае Конституционный суд пришел к выводу, что законодательство не позволяет потерпевшему возместить свои расходы на представителя в уголовном деле, которое прекратили по нереабилитирующему основанию еще до суда.

Пока законодатель не изменит УПК, КС предложил свои правила возмещения:

  • возмещаются даже те деньги, которые человек потратил еще до того, как его признали потерпевшим;
  • государство платит компенсацию, даже если правоохранители ни в чем не виноваты;
  • учитывается инфляция;
  • необходимость, оправданность и размер расходов на представителя оценивает суд.

Пересмотр дела

Обычно, чтобы пересмотреть дело по новым или вновь открывшимся обстоятельствам, суду нужно соответствующее заключение прокурора. Но бывают случаи, когда прокурор и суд расходятся в оценке необходимости пересмотра: суд раз за разом отменяет прокурорские постановления, а прокурор не выносит заключения о пересмотре.

Это может неоправданно затянуть процесс и стать препятствием для правосудия. В таких экстраординарных ситуациях суд вправе вместе с отменой прокурорского постановления отменить и приговор, направив уголовное дело на новое рассмотрение либо прекратив его, указал КС в своем декабрьском постановлении. При этом он отметил, что воспользоваться таким правом суд может, только если пересмотр улучшит положение осужденного.

  • Кира Климачева

Videos

1. О чём договорились Лавров и Блинкен. Брифинг главы МИД РФ по итогам переговоров. Прямая трансляция

(FЯchannel)

Dmitry F: Youtube: https://www.youtube.com/channel/UCCzrrMuF4QrHojWouv8eN9w Инстаграм: …

3. Пресс-конференция Сергея Лаврова по итогам встречи с госсекретарем США от 21.01.22

(Россия 24)

Пресс-конференция Сергея Лаврова по

4. Финансовые итоги 2021 с Гариком Мартиросяном | «Время деньги» s1e5

(Дмитрий Романов)

Новогодний выпуск подкаста «Время деньги», который мы ведем вместе с Ренатом Малиным — Директором по инвестициям . ..

5. «Итоги недели с Ирадой Зейналовой»: 26 декабря 2021 года

(НТВ)

00:00 Выпуск 00:01 Россия сосредотачивается: что станет главной политической темой 2022 года. 10:31 Украина смещает …

6. «Итоги недели с Ирадой Зейналовой»: 19 декабря 2021 года

(НТВ)

00:00 Выпуск 00:01 Как украинские власти готовят людей к «войне с Россией». 10:17 Пенсионеры Донбасса становятся …

7. Понасенков: итоги 2021 и прогнозы | Пресс-конференция НСН

(Канал здравого смысла: блог Евгения Понасенкова)

Пресс-конференция знаменитого ученого и режиссера, Евгения Понасенкова, в Национальной службе новостей …

8. «Настоящее время. Америка» – 4 октября 2021

(Голос Америки)

«Архив Пандоры»: СМИ опубликовали новое расследование об использовании политиками и бизнесменами офшоров для . ..

9. Чего хочет Путин, почему не арестовали Порошенко, тайный визит главы ЦРУ #НАБЕЛО

(Власть vs Влащенко)

НАБЕЛО #131: субъективные

10. «Настоящее время. Америка» – 4 января 2021

(Голос Америки)

Трамп пытался убедить секретаря-республиканца из Джорджии изменить результаты выборов и получил отказ // Новый . ..

Source: https://theprosepost.com, when copying, remember to write the source https://theprosepost.com

You might also like

Author information

Name: Prof. Nancy Dach

Birthday: 1993-08-23

Address: 569 Waelchi Ports, South Blainebury, LA 11589

Phone: +9958996486049

Job: Sales Manager

Hobby: Web surfing, Scuba diving, Mountaineering, Writing, Sailing, Dance, Blacksmithing

Introduction: My name is Prof. Nancy Dach, I am a lively, joyous, courageous, lovely, tender, charming, open person who loves writing and wants to share my knowledge and understanding with you.

Post Comments

Влияние подавления генов высокого содержания белка в зерне (GPC) на транскриптом пшеницы во время монокарпического старения питательных веществ для значительной части населения мира.

Современные сорта пшеницы различаются по концентрации азота, цинка и железа в зерне [1], и, следовательно, повышение питательной ценности зерна пшеницы возможно и может уменьшить дефицит питательных веществ.Кроме того, увеличение содержания белка в зерне (N) связано с улучшением качества макаронных изделий и хлеба и, следовательно, вознаграждается более высокими ценами во многих регионах выращивания пшеницы.

Содержание питательных веществ в зерне пшеницы зависит от ремобилизации аминокислот и питательных веществ из вегетативных тканей в зерно во время старения всего растения [2-4]. У монокарпических растений, таких как пшеница, старение представляет собой скоординированный процесс, действующий на уровне всего растения, во время которого генетически запрограммированная и контролируемая развитием катаболическая активность превращает клеточный материал в пригодные для экспорта питательные вещества, которые ремобилизуются из листьев в зерно [5, 6].Таким образом, ремобилизация питательных веществ и старение являются неразрывно связанными процессами, и дальнейшее улучшение питательной ценности зерна потребует лучшего понимания регуляторных сетей генов, контролирующих оба процесса. К сожалению, эта стадия развития не была тщательно изучена, о чем свидетельствует отсутствие специализированных библиотек старения в доступных в настоящее время ресурсах EST пшеницы в NCBI.

Монокарпическое старение представляет собой активный процесс, во время которого растение должно разбирать сложные молекулы, усиливать активные транспортные механизмы и поддерживать функциональные проводящие ткани, одновременно координируя запрограммированную гибель истощенных клеток листа.Различные растительные гормоны координируют инициацию и развитие этих процессов, при этом абсцизовая кислота (АБК) играет центральную роль (обзор в [7,8]). Этот гормон, по-видимому, является первичным сигналом, производимым во время индукции старения как засухой, так и высокой температурой [9]. Несколько линий доказательств также указывают на важную роль других гормонов, включая жасмоновую кислоту (ЖК) [10], салициловую кислоту (СК) [11,12] и этилен [13].

Клетки листа претерпевают значительные физиологические и метаболические изменения при инициации и прогрессировании монокарпического старения. Одной из самых ранних реакций при старении является деградация фотосинтетического аппарата. Хлоропласты, на долю которых приходится примерно три четверти органического азота клеток мезофилла, разрушаются в начале старения [6,14]. Белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты расщепляются, а продукты катаболизма поступают в наполняющие зерна [7,14,15]. По мере гидролиза RUBISCO и других белков хлоропластов протеолитическими ферментами увеличивается клеточный и флоэматический пулы свободных аминокислот, что ускоряет их ремобилизацию в зерна [16].Ремобилизация питательных микроэлементов (например, Zn, Fe и др.) через мембраны растений (обзор в [17]) опосредуется переносчиками, кодируемыми различными семействами генов. Различные семейства генов-транспортеров обладают как специфической, так и перекрывающейся способностью переносить различные катионы металлов, потенциально действуя согласованно, чтобы регулировать ремобилизацию питательных микроэлементов в развивающееся зерно.

Исследования экспрессии генов с использованием технологий микрочипов у Arabidopsis [11,18,19], Populus [20], ячменя [21] и пшеницы [22] показали, что старение управляется сетями факторов транскрипции, которые регулируют своевременную экспрессию сотни генов, ассоциированных со старением (SAG), иллюстрирующих, как спасение питательных веществ требует сложного набора регуляторных сетей и метаболических путей [7]. Сложность множественных генных сетей, участвующих в инициации и прогрессировании старения, затрудняет расшифровку взаимодействий между отдельными генами и идентификацию центральных узлов регуляторной сети старения.

Существование тесной связи между старением и ремобилизацией питательных веществ было также очевидно в одновременном воздействии гена GPC-B1 ( Grain Protein Content 1 ) на оба процесса. Сегмент хромосомы 6В, включающий этот ген, первоначально был интрогрессирован из дикой эммеровой пшеницы ( Triticum turgidum ssp. dicoccoides ) в твердую и обычную пшеницу в качестве источника генетической изменчивости содержания белка в зерне [23], а позже было показано, что он ускоряет старение [24]. Позиционное клонирование этого гена показало, что GPC-B1 является фактором транскрипции NAC, родственным гену Arabidopsis NAC-LIKE, ACTIVATED BY AP3/PI ( NAP ), который также участвует в регуляции старения листьев. как и другие члены семейства NAC [25-28]. Паралогичный ген, обозначенный GPC-2 , присутствует на хромосомах 2B ( GPC-B2 ) и 2D ( GPC-D2 ) гексаплоидной пшеницы и демонстрирует профиль транскрипции, аналогичный GPC-B1 [3]. .

Большинство коммерческих сортов макарон и мягкой пшеницы имеют нефункциональную копию GPC-B1 , а добавление функциональной копии из дикой пшеницы увеличивает концентрацию N, Fe и Zn в зерне пшеницы [3]. Напротив, подавление всех функциональных копий GPC в трансгенных гексаплоидных растениях пшеницы, экспрессирующих стабильную конструкцию РНК-интерференции (GPC-RNAi), значительно замедляло старение (> трех недель) и уменьшало ремобилизацию N, Fe и Zn в зерне пшеницы. (>30%) [3,29].

Ген GPC быстро активируется после цветения до появления каких-либо видимых симптомов старения, что позволяет предположить, что он является ранним положительным регулятором старения. Таким образом, доступные GPC-RNAi трансгенные растения пшеницы и их нетрансгенный контроль представляют собой прекрасную отправную точку для изучения генных сетей, регулирующих старение пшеницы. Подходы прямого секвенирования кДНК (mRNA-seq) для профилирования транскриптома с использованием технологий секвенирования следующего поколения обеспечивают методы с высоким разрешением для количественного определения уровней экспрессии генов в масштабе всего генома [30].Чтобы начать расшифровку транскриптома, зависимого от GPC-, мы применили технологию пиросеквенирования Roche 454 (454) для сборки транскриптома de novo и системы Illumina для количественной оценки экспрессии 30 497 контигов, представляющих 14 735 генов пшеницы.

Сравнение транскриптомов флаговых листьев линий дикого типа и трансгенных линий GPC-RNAi через 12 дней после цветения выявило набор генов, вероятно регулируемых GPC на ранних стадиях монокарпического старения пшеницы.

Результаты

Сборка транскриптома De novo

Сверхэкспрессия конструкции GPC-RNAi, регулируемая промотором 35S, снижала уровни транскриптов всех гомеологичных копий GPC-1 и его близкого паралога GPC-2 (далее GPC ) примерно на 35% через 12 дней после цветения (DAA) и на 67% через 22 дня DAA по сравнению с нетрансгенными сестринскими линиями дикого типа (WT) (рис. ). Как сообщалось ранее, старение растений GPC-RNAi задерживалось примерно на три недели [3].Чтобы исследовать влияние подавления факторов транскрипции GPC на ранние стадии старения, мы сосредоточили наши исследования сборки транскриптома 454 de novo и экспрессии Illumina на образцах РНК, собранных из флаговых листьев в 12 DAA, когда GPC Уровень транскриптов составляет примерно одну треть от их уровня на пике транскрипции [3]. В этот момент времени трансгенные растения GPC-RNAi демонстрировали значительно более низкие уровни транскриптов GPC , чем контроли дикого типа, но ни один из генотипов не проявлял визуальных признаков старения (например,г. пожелтение цветоноса и потеря хлорофилла листьями, рис., [3]). ‘Bobwhite’ (сорт, используемый для получения трансгенных растений) часто показывает некроз кончиков листьев, но это наблюдалось с одинаковой частотой у обоих генотипов и не было связано с началом терминального старения. Даже через 22 DAA, когда были собраны дополнительные образцы для изучения динамики qRT-PCR, все еще не было видимых признаков старения ни для одного из генотипов (дополнительный файл 1, рисунок S1).

Растения WT и GPC-RNAi через 12 дней после цветения . (A) WT (слева) и растения GPC-RNAi в 12 DAA использовали для анализа GPC -зависимых транскрипционных изменений. (B и C) Крупный план початков (B) и флаговых листьев (C) растений дикого типа (слева) и растений GPC-RNAi (справа) через 12 DAA. (D) Профиль экспрессии генов GPC по отношению к ACTIN в растениях WT и GPC-RNAi в зависимости от времени старения листа (H = кочан, D = дни после цветения). Уровни транскрипта представлены как нормализованные, линеаризованные значения из 10 биологических повторов (± SEM), полученные методом 2 -ΔΔ C t [36], где Ct — пороговый цикл.* Р≤0,05, ** Р≤0,01. (E) Кластеризация образцов на основе количества прочтений Illumina, нанесенных на карту на 454 контигах. Дендрограмма представляет собой иерархическую кластеризацию выборок, определяемую евклидовым расстоянием. Тепловая карта показывает ложное цветовое представление матрицы евклидовых расстояний (от красного для нулевого расстояния до белого для большого расстояния).

Поскольку транскриптом старения пшеницы не был доступен для использования в качестве эталона, мы создали сборку транскриптома de novo из флаговых листьев через 12 дней после цветения с использованием платформы для секвенирования 454.Эта технология генерирует более длинные транскрипты, чем Illumina, облегчая сборку de novo [31]. Мы секвенировали четыре биологических повтора для каждого генотипа, используя два цикла 454 (два растения дикого типа и два трансгенных растения GPC-RNAi за цикл) и произвели 1 469 817 прочтений со средней длиной последовательности 415 нуклеотидов (дополнительный файл 1, рисунок S2A). Количество прочтений на одно растение описано в дополнительном файле 1, таблица S1).

Восемьдесят процентов прочтений (1 179 902) были собраны в 30 696 контигов со средней длиной 934 нуклеотида (дополнительный файл 1, рисунок S2B). Контиги были собраны с использованием параметров GS Assembler по умолчанию (не менее 40 п.н. перекрываются и не менее 90% идентичны), и, как следствие, гомеологичные копии одного и того же гена обычно собирались в одном и том же контиге. Одиннадцать процентов прочтений (163 528) не были собраны в контиги и в дальнейшем называются одиночными (средняя длина 304 нуклеотида). Девяносто процентов этих одиночек показали значительное сходство либо с EST пшеницы (коллекция EST GenBank пшеницы: 1 071 199 последовательностей; BLASTN, E-значение ≤ e -10 ), либо с белками риса (коллекция белков nr риса GenBank: 275 532 последовательности; BLASTX, E- значение ≤ e -10 ).Последовательности 146 671 синглтона, которые показывают сходство с любой из этих баз данных, доступны в виде файла с несколькими файлами Fasta в дополнительных онлайн-материалах (дополнительный файл 2). Оставшиеся 9% от общего числа 454 последовательностей (126 387) были исключены на основании различных критериев качества (см. Материалы и методы).

Почти 95% из 454 контигов (29 037) показали высокий уровень сходства с EST пшеницы (97,4% ± 3,2 средняя идентичность ± SD) на большей части их длины (80,4% ± 24,7 средняя длина выравнивания ± SD).Семьдесят девять процентов контигов (24 076) также продемонстрировали значительное сходство (BLASTX, значение E ≤ e -10 ) с последовательностями в коллекции белков риса GenBank nr (79,2% ± 14,8 средняя идентичность ± стандартное отклонение) более чем в половине случаев. их длина (63,3% ± 31,4 длины выравнивания ± стандартное отклонение). Среди 912 последовательностей, которые не проявляли сходства ни с одной из последовательностей EST пшеницы или белков риса, 199 показали высокое сходство с последовательностями насекомых (172), грибов (14), бактерий (7) и вирусов (6) (BLASTN, % идентичности). ≥ 90%; значение E ≤ e -10 ; включен фильтр низкой сложности).Эти последовательности считались загрязнителями и были исключены из дальнейшего анализа, в результате чего количество контигов, включенных в это исследование, сократилось до 30 497. Пятьдесят процентов нуклеотидов были включены в контиги из 1563 нуклеотидов или длиннее (N50 = 1563). В общей сложности 4692 контига (15,3%) были длиннее 2000 нуклеотидов (дополнительный файл 1, рисунок S2B). Среднее покрытие составило 36,8 ± 1,4 прочтения на контиг ± стандартное отклонение.

30 497 контигов были далее сгруппированы в 14 735 изогрупп. Изогруппы определяются в GS Assembler как набор контигов, содержащих риды, которые подразумевают связи между ними, и ожидается, что они будут включать альтернативные варианты сплайсинга, а также гомеологи (копии A, B и D) и близкие паралоги.Большинство изогрупп состояло только из 1 контига (65,7% 1 контиг/изогруппа и 18,3% 2 контига/изогруппа). Медиана длины последовательностей, образующих каждую изогруппу, составила 685 нуклеотидов. Идентификаторы собранных последовательностей, соответствующие изогруппы и инвентарные номера GenBank перечислены в дополнительном файле 3. различных изогрупп между растениями WT и GPC-RNAi в 12 DAA мы использовали платформу Illumina, которая обеспечивала гораздо большую среднюю глубину секвенирования на библиотеку, чем платформа 454 (дополнительный файл 1, рисунок S3). Сводка необработанных и усеченных ридов Illumina представлена ​​в дополнительном файле 1, таблица S2.

В качестве контроля качества риды были выровнены по 1138-нуклеотидному интрону риса Waxy-a, последовательности, присутствующей в векторе pMCG161 RNAi, но отсутствующей в геноме пшеницы. В среднем 858 прочтений, картированных с интроном Waxy-a для четырех образцов GPC-RNAi, без пропусков и несоответствий, разрешенных с помощью Bowtie [32]. Как и ожидалось, нулевые прочтения были картированы с последовательностью вектора в последовательностях, полученных из образцов дикого типа WT1, WT2 и WT3.Однако 301 прочтение, выровненное с интроном Waxy-a среди последовательностей, созданных из библиотеки Illumina из образца WT4, указывает на то, что библиотека WT4 была контаминирована РНК из трансгенных растений GPC-RNAi. Поэтому этот образец был исключен из дальнейшего анализа.

После обрезки областей низкого качества и примесей вектора и исключения прочтений низкого качества (см. Методы) из семи образцов был получен окончательный набор из 145 миллионов прочтений со средней длиной 50 нуклеотидов. Эти чтения были сопоставлены с 30 497 контигами (дополнительный файл 1, таблица S2) для определения их относительных уровней транскриптов (см. Материалы и методы). Из 145 миллионов высококачественных прочтений Illumina 89 миллионов (61,8%) сопоставлены с 30 378 контигами (99,6%), что соответствует среднему охвату 22,2× (nt/nt) покрытия на библиотеку (дополнительный файл 1, рис. S3 и таблица S3). . Из 56 миллионов прочтений (38,2% от общего числа), которые не соответствовали 454 контигам, 14 миллионов (9,5% от общего числа) и 13 миллионов (9.2% от общего числа) картировано на 81 230 одиночек и 40 996 унигенов пшеницы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID=4565) соответственно. В совокупности чтения Illumina, выровненные с контигами, синглетами и унигенами, составляют 79,9% от общего числа прочтений Illumina. Неспособность сопоставить 19,5% остаточных прочтений с любым из трех эталонных наборов, описанных выше, можно объяснить (i) отсутствием этих последовательностей пшеницы во всех трех эталонах, (ii) более высоким расхождением последовательностей между прочтениями и эталоном, чем сходством отсечение (максимум 3 полиморфизма на чтение, используемое в качестве параметра выравнивания), (iii) контаминация транскриптов из других организмов или комбинация этих трех факторов.

Это исследование сосредоточено на сравнении уровней транскриптов WT и GPC-RNAi при 12 DAA для 14 735 изогрупп, собранных с помощью 454-секвенирования. Прочтения, сопоставленные с контигами в одной и той же изогруппе, суммировали, чтобы получить количество для каждой изогруппы. Таблицы, включающие дифференциально выраженные синглетоны и унигены пшеницы, включены в качестве вспомогательных онлайн-материалов для тех, кто интересуется расширенным набором данных дифференциально регулируемых генов (дополнительные файлы 4 и 5).

Поскольку общее количество прочтений, полученных для разных биологических повторов, не было одинаковым, подсчеты были нормализованы, чтобы свести к минимуму влияние этого систематического технического отклонения.Мы использовали процедуру нормализации, реализованную в программном пакете R/Bioconductor DESeq, которая использует библиотечную медиану отношений между числом прочтений и средним геометрическим для каждого гена в качестве коэффициента масштабирования для каждой библиотеки ([33]; дополнительный файл 1, рисунок S4). ). Все статистические анализы, описанные ниже, используют нормализованные наборы данных.

Общая характеристика подсчетов Illumina

Мы наблюдали высокий коэффициент корреляции момента произведения Пирсона между нормализованными подсчетами Illumina и 454 последовательностями ( R = 0.73, P < 0,0001). Рисунок показывает, что эта корреляция даже лучше для генов с высоким количеством Illumina. Эти значимые корреляции указывают на то, что в целом для обеих технологий были получены аналогичные результаты. Однако низкое среднее количество на изогруппу в наборе данных 454 (5 прочтений/изогруппа) по сравнению с набором данных Illumina (863 прочтений/изогруппа) привело к гораздо более высокому коэффициенту вариаций в наборе данных 454 (93%), чем в наборе данных 454. Набор данных Illumina (20%). Поэтому мы использовали только подсчет секвенирования Illumina для оценки уровней экспрессии генов.

Сравнение результатов 454 и Illumina mRNA-seq . (A) Диаграмма рассеяния log 2 трансформировала 454 и количество Illumina в растениях WT и GPC-RNAi. Красные линии представляют локально взвешенную полиномиальную регрессию (метод LOWESS). (B) Графики Volcano, показывающие величину коэффициентов экспрессии генов (log 2 ) в зависимости от значимости различий в экспрессии между двумя генотипами, отображаются на оси y [-log 10 ( P -значение в DESeq)].Вертикальные красные линии ограничивают двойное регулирование вверх и вниз, а горизонтальная синяя линия соответствует пороговому значению P , равному 0,01. Красные и зеленые кружки соответствуют, соответственно, изогруппам с повышающей и понижающей регуляцией, значимыми как для edgeR ( P ≤0,01), так и для тестирования MWW ( P ≤ 0,05).

Чтобы определить, приводит ли подавление гена GPC в трансгенных растениях к значительным изменениям в транскриптоме, мы провели иерархическую кластеризацию семи образцов, используя евклидово расстояние в качестве меры сходства между профилями экспрессии. Как требовалось для расчета расстояния, нормализованные значения были дополнительно преобразованы для достижения гомоскедастичности с использованием функции «getVarianceStabilizedData» в пакете DESeq [33]. Биологические повторы были разделены на два основных кластера, один из которых включал четыре образца GPC-RNAi, а другой включал три растения дикого типа (рис. ). Та же самая группировка наблюдалась, когда подсчеты прочтений, сопоставленных с одиночными генами и унигенами пшеницы, были проанализированы отдельно, что указывает на согласованный биологический сигнал в этих трех независимых наборах данных (дополнительный файл 1, рисунок S5).Анализ основных компонентов (PCA) подтвердил результаты иерархической кластеризации (дополнительный файл 1, рисунок S6): на основной главный компонент (PC1) приходится большая часть вариаций (PC1: 61,6%; PC2: 13,6%; PC3: 7,8%) и явно отделили реплики от двух разных генотипов, что предполагает, что большая часть вариации в этом наборе данных связана с дифференциальной экспрессией нескольких генов в двух генотипах.

Идентификация генов с дифференциальной экспрессией

Для идентификации генов с дифференциальной экспрессией между растениями GPC-RNAi и WT мы использовали консервативный подход.Сначала мы определили изогруппы, которые показали значительные различия в нормализованном количестве между обработками как в статистическом анализе DESeq [33], так и в статистическом анализе edgeR [34].

Значения P , полученные в результате обоих анализов, были скорректированы с учетом частоты ложных открытий (FDR) в нескольких тестах с использованием процедуры Бенджамини и Хохберга, реализованной в пакете R/Stats [35]. Далее значения DESeq и edgeR P относятся к скорректированным значениям P . Используя этот критерий, всего 245 (1.7%) показали значительно более высокое количество транскриптов в WT по сравнению с образцами GPC-RNAi (повышающая регуляция во время старения), а 570 (3,9%) показали значительно более низкое количество транскриптов в WT по сравнению с образцами GPC-RNAi (понижающая регуляция). регулируется во время старения) одновременно в обоих статистических анализах ( P ≤0,01; рисунок; дополнительный файл 6). Шестьдесят процентов из 815 дифференциально регулируемых изогрупп показали более чем двукратную дифференциальную экспрессию. Точки данных экспрессии генов по отношению к их статистической значимости представлены в виде графиков вулканов на рисунке , который показывает избыток генов со значительной отрицательной регуляцией (зеленые точки) над генами со значительной положительной регуляцией (красные точки).

Сравнение наборов дифференциально регулируемых изогрупп, выявленных с помощью различных подходов к статистическому тестированию . На диаграммах Венна показаны перекрывающиеся и уникальные наборы изогрупп со значительной положительной и отрицательной регуляцией, идентифицируемых с помощью теста Манна-Уитни-Уилкоксона (MWW) или программных пакетов R/Bioconductor edgeR и DESeq. Значения в скобках обозначают изогруппы с ≥ 2-кратным дифференциальным выражением.

Для дальнейшего подтверждения различий между образцами WT и GPC-RNAi мы повторили тот же статистический анализ между группами, включая перестановки образцов.Были проанализированы и усреднены десять различных перестановок, дающих два образца GPC-RNAi и два образца WT в одной группе и два образца GPC-RNAi и один образец WT в другой (из-за исключения образца WT4). Тесты edgeR и DESeq для 10 различных перестановок показали 22 ± 3 и 18 ± 1 значимых изогрупп ± SE на перестановку ( P≤ 0,01) соответственно. Если мы рассмотрим только пересечение между двумя тестами, в среднем 15 ± 4 изогруппы будут идентифицированы как значительно дифференциально регулируемые.Эти анализы перестановок также обеспечили косвенную оценку частоты ошибок первого рода в нашем экспериментальном подходе. 15 изогрупп, показывающие статистически значимые различия, представляют 1,8% из 815 генов, которые показали значительные различия между образцами GPC-RNAi и WT. Эта доля ложноположительных результатов на 80 % выше теоретического 1 % FDR, используемого в наших анализах ( P≤ 0,01).

Более высокая, чем ожидалось, частота ошибок типа I, предложенная анализом перестановок, побудила нас включить дополнительный статистический фильтр, чтобы уменьшить количество потенциальных ложных срабатываний и сузить набор генов для дальнейшей характеристики.Мы включили дополнительный критерий Манна-Уитни-Вилкоксона (MWW) между WT и GPC-RNAi ( P ≤0,05), который уменьшил количество изогрупп со значительными различиями между обработками с 815 (≥ 2-кратное изменение: 491) до 691 (≥ 2-кратное изменение: 431; Доп. файл 7). Мы осознаем, что этот консервативный подход увеличивает количество реальных дифференциально регулируемых изогрупп, исключенных из дальнейшего анализа (ложноотрицательные результаты), и по этой причине мы включаем оба набора данных в дополнительный файл 6 (815 генов, значительно различающихся как в статистическом анализе DESeq, так и в статистическом анализе edgeR). и Дополнительный файл 7 (691 ген, значимый в тестах DESeq, edgeR и MWW).

Подтверждение различий в экспрессии генов с помощью qRT-PCR

qRT-PCR использовали для проверки дифференциальной экспрессии 22 изогрупп, которые показали ≥2-кратные значимые различия в количестве транскриптов между обработками во всех трех статистических анализах (DEseq≤0,01, edgeR ≤0,01 и MWW≤0,05 Дополнительный файл 7). Из 431 изогруппы, удовлетворяющей всем четырем критериям, мы выбрали 10 генов с повышенной и 12 с отрицательной регуляцией для дальнейшей проверки. Они включали изогруппы, охватывающие ряд различных соотношений экспрессии между генотипами и генами, которые представляли биологический интерес для нашей группы, включая транспортеры, сигнальные компоненты и гены, связанные с гормонами (дополнительный файл 1, таблица S4).Мы выбрали ACTIN (ген AB19881.1) в качестве эндогенного контрольного гена для анализа экспрессии генов, поскольку этот ген успешно использовался в предыдущих исследованиях стареющих листьев [3]. Данные Illumina и 454 подтвердили, что на экспрессию ACTIN , соответствующего изогруппе 01906 в нашем наборе данных, не влияет экспрессия конструкции GPC-RNAi (кратность изменения = 1,05, P edgeR = 0,86 и P ). DESeq = 0,90) на данный момент времени.Все данные qRT-PCR нормализовали относительно экспрессии ACTIN с использованием метода 2 -ΔΔ C t [36].

Соотношения транскрипции между трансгенными образцами и образцами дикого типа, полученные с помощью qRT-PCR, значительно коррелировали с соответствующими соотношениями, определенными по нормализованному количеству Illumina ( R = 0,83, рис. ). Несмотря на эту общую высокую корреляцию, только 9 из 22 протестированных генов (41%) показали значительные различия ( P ≤0.05) между трансгенными растениями и растениями дикого типа при измерении с помощью qRT-PCR (таблица).

Корреляция между нормализованными результатами секвенирования мРНК и значениями экспрессии qRT-PCR . Диаграмма рассеяния, показывающая отношения изменения экспрессии генов по подсчетам Illumina и qRT-PCR. Показана линейная линия тренда. Значения корректируются таким образом, чтобы начало графика равнялось 1 (без изменения относительного выражения).

Таблица 1

Сравнение соотношений уровней транскриптов между WT и GPC-RNAi в экспериментах Illumina (12 DAA) и qRT-PCR (12 DAA и 22 DAA).

90 233 4 Соотношение
QRT-ПЦР
12 DAA 22 DAA

изогруппой Illumina соотношение Коэффициент P P
IsoGroup10136 8. 745 4,976 4,976 0.004 6.472 0
Isogroup08662 5,887 2,11 0,018 2,021 0,001
Isogroup14133 3,303 0,983 0,955 1,208 0,78
Isogroup10811 3. 226 2.183 0.034 4.795 4.795 0,005
Isogroup12718 2,917 1.67 0.189 1,8 0,018
Isogroup06043 2,797 1,761 0,04 2,088 0,045
Isogroup02905 б 2,292 1,349 0,192 2. 8 0,008
ISogroup03083 0.939 0.839 0.638 0.638 1.904 1.904 0.104 0.108
Isogroup10053 B 2.19 +1,017 0,92 1,094 0,572
Isogroup01211 б 2,052 0,806 0,506 1,582 0,119
Isogroup11278 б 0,471 0,764 0. 18 0.18 0,726 0.114
Isogroup05843 B 0.448 0.852 0.316 0.827 0,068
Isogroup03470 б 0,445 0,863 0,271 0,845 0,063
Isogroup13287 б 0,422 1,012 0,942 0,853 0,427
IsoGroup13088 0. 393 0.698 0.050 0.050 0.843 0,492
Isogroup06482 0.365 0,916 0,461 0,924 0,605
Isogroup10940 0,333 0,739 0,018 0,631 0,917
Isogroup10620 0,272 0,716 0,029 1,068 0. 732
IsoGroup13722 0.267 0,267 0.606 0.005 0.522 0.522 0.336
Isogroup07898 0.254 0,97 0,816 0,882 0,325
Isogroup06574 0,237 0,973 0,782 0,759 0,063
Isogroup07736 0,199 0,62 0,015 0,975 0,912

Высокая вариабельность результатов количественной ОТ-ПЦР между растениями может частично объяснить относительно низкий уровень валидации. Линеаризованные уровни транскриптов 22 выбранных генов показали относительно большие коэффициенты вариации (CV, в среднем 44%) среди растений для обоих генотипов со значительной вариацией между генами: 95% доверительный интервал для CV составлял от 38% до 50%. Принимая во внимание эти значения CV и ошибку типа I, равную 5 %, вероятность обнаружения двукратных различий между двумя группами с использованием десяти повторов варьируется от 75 % (для 50 % CV) до 95 % (для 38 % CV). Низкая мощность, продемонстрированная статистическими тестами, выполненными для нескольких генов, возможно, способствовала низкой доле генов, которые показали значительные различия в проверочных анализах qRT-PCR.В поддержку этого аргумента ни одна из 8 изогрупп с различиями между 2 и 2,5 раза не была значимой в анализе qRT-PCR ( P >0,05, таблица). Если мы включим в анализ только 14 генов с кратностью изменений выше 2,5 (или ниже 0,4), степень валидации увеличится с 41% до 64% ​​(9 из 14). Кроме того, два из тринадцати незначимых генов в анализе qRT-PCR, выполненном на образцах, собранных из 12 DAA, оказались значимыми во втором наборе образцов, собранных из 22 DAA. Большее относительное снижение уровней транскриптов GPC при 22 DAA (67%) по сравнению с 12 DAA (35%, рис. 10) может объяснить увеличение значимости некоторых из выбранных генов (таблица).

В совокупности результаты наших экспериментов с qRT-PCR показывают высокую корреляцию между qRT-PCR и результатами Illumina с хорошей степенью проверки среди генов, которые показали различия между двумя генотипами более чем в 2,5 раза при 12 и 22 DAA.

Анализ

генов, регулируемых GPC , на протяжении периода раннего старения

Все 11 изогрупп, которые показали значительные различия (MWW P≤ 0.05) в уровнях транскриптов с помощью qRT-PCR либо в 12 DAA, либо в 22 DAA в наших первоначальных анализах были выбраны для независимого, более подробного анализа экспрессии, включающего четыре временных момента от зачатия до 22 DAA.

Данные по шести генам, трем активным и трем негативным, представлены на рисунке . Три гена с повышенной регуляцией включают; изогруппа 08662 с гомологией гену, содержащему жакалин-подобный лектиновый домен ({«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»ABB51090. 1″,»term_id»:»78714216″,» term_text»:»ABB51090.1″}}ABB51090.1), изогруппа 10136 с гомологией белку, индуцированному АБК ({«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»Q09134.1″,»term_id»:» 1170023″,»term_text»:»Q09134.1″}}Q09134.1) и изогруппу 10811 с ​​гомологией членам семейства нодулинов MtN3 ({«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text» :»Q0DJY3″,»term_id»:»322967644″,»term_text»:»Q0DJY3″}}Q0DJY3.2). Все три гена показали постепенное увеличение разницы в уровнях транскриптов между WT и GPC-RNAi во время прогрессирования старение, что соответствует профилям транскрипции гена GPC (рис. ).Уровни транскрипции изогрупп 08662 и 10136 почти не обнаруживаются в момент колошения, тогда как изогруппа 10811 сильно экспрессируется во время колошения и только после цветения проявляет дифференциальную регуляцию между двумя генотипами (рис. 1). Значимость различий в уровнях транскриптов между WT и GPC-RNAi увеличивалась между 12 и 22 DAA для всех трех изогрупп с повышающей регуляцией (рис. 1).

Уровни транскрипции выбранных изогрупп в ходе старения листа во времени . Уровни экспрессии в растениях WT и GPC-RNAi определяли с помощью qRT-PCR в четырех точках на протяжении времени старения листьев (H = колошение, D = дни после цветения). Уровни транскрипта представлены в виде нормированных линеаризованных значений по методу 2 -ΔΔ C t [36], где Ct — пороговый цикл. Значения корректируются с использованием одного и того же калибратора для разных генов, поэтому шкала уровня транскриптов сопоставима между изогруппами. Каждая точка данных представляет собой среднее значение, основанное на десяти растениях (± стандартная ошибка среднего).* Р≤0,05, ** Р≤0,01.

Три гена с пониженной экспрессией, показанные на рисунке, включают изогруппу 10940, которая демонстрирует высокую гомологию с NAC2 , геном риса, родственным гену GPC ({«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{ «text»:»BAD09612.1″,»term_id»:»42408430″,»term_text»:»BAD09612.1″}}BAD09612.1), изогруппа 10620 с гомологией белку-шаперону ({«type»:»entrez -protein»,»attrs»:{«text»:»ABF96724″,»term_id»:»108708929″,»term_text»:»ABF96724″}}ABF96724) и изогруппа 13722 с гомологией гена устойчивости к болезням LRR ({ «type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «BAD68095», «term_id»: «55296769», «term_text»: «BAD68095»}}BAD68095). Все три гена демонстрируют схожие профили экспрессии с примерно четырехкратным снижением экспрессии между датой колошения и 22 DAA. Однако уровни транскриптов в растениях WT снижались до базового уровня быстрее, чем в растениях GPC-RNAi, что приводило к значительно более низким уровням транскриптов в WT, чем в растениях GPC-RNAi, при 12 DAA ( P ≤0,05) для всех трех генов. Эти различия исчезали к 22 ДАА, когда оба генотипа достигли общего низкого уровня транскриптов. Остальные пять изогрупп показывают значимость ( P ≤0.05) дифференциальная регуляция либо при 12 DAA, либо при 22 DAA также была протестирована в течение времени старения в независимом эксперименте, и данные доступны в качестве дополнительного онлайн-материала (дополнительный файл 1, рисунок S7).

Генная онтологическая аннотация

Для получения широкой классификации функций генов аннотация GO-slim была присвоена на основе терминов GO-slim, связанных с гомологичными генами риса [37,38]. Поиск гомологии с использованием BLASTX (значение E < 1 e -5 ) и предсказанных пептидов риса в качестве базы данных показал значительное сходство для 78% из 14 735 изогрупп пшеницы. Среди 815 изогрупп 12 DAA со значительной повышающей и понижающей регуляцией ( P ≤ 0,01 как для edgeR, так и для DESeq; таблица S6) значительные совпадения с известными белками риса были обнаружены в большей пропорции среди генов со сниженной регуляцией (91%). ), чем среди генов с повышающей регуляцией (40%). Точно так же термины GO-slim для биологического процесса, связанного с гомологичными генами риса (Проект аннотации генома риса; http://rice.plantbiology.msu.edu/), были присвоены только 10,0% из 245 генов с повышенной экспрессией, в отличие от до 45.6% из 570 подавляющих изогрупп. Предполагаемые гомологи риса и присвоенные номера GO для молекулярных функций и биологических процессов перечислены в дополнительном файле 3, а сводка относительного распределения категорий GO-slim для наиболее представленных функциональных терминов представлена ​​в таблице.

Таблица 2

Распределение функциональной группировки собранных изогрупп на основе аннотации GO-slim.

9.9
Присоединение Онтология Итого До регулируемой понижающей регуляции
ГО: 0019538 белок метаболический процесс 5. 1 13,9 5,1
ГО: 0009987 клеточный процесс 7,2 12,4 7,2
ГО: 0006950 ответ на стресс 13,9 10,2 12
Go: 0006810 Транспорт 3.4 8.0 8.0 4. 3
Go: 0009719 Отзывы на эндогенный стимул 79 8.0 8,5
GO: 0009056 катаболический процесс 2,8 7,3 1,8
GO: 0009607 ответ на биотический раздражитель 4,1 5,1 5,5
Go: 0007165 преобразования сигнала 80285 8. 7 4,4 9.9 9.9
GO: 0006464 Процесс модификации белка 10.6 3.6 8,3
ГО: 0006350 транскрипции 2 3,6 1,9
ГО: 0009628 ответ на абиотические стимул клеточной организации компонента 3,2 1,9 2,6
Go: 0016043 и биогенез 3. 4 3,4 0,7 4,5
Go: 0008152 Средний метаболический процесс 2,8 0.7 1,8
ГО: 0009058 биосинтетических процесс 2,7 0,7 3
ГО: 0006412 перевод 3,7 0,0 1,9
Другие 18,5 19,5 21,7

Мы наблюдали значительные различия в относительном распределении функциональных групп между повышающими и понижающими генами (критерий Колмогорова-Смирнова: P 900)002), а также мы наблюдали достоверное изменение распределения функциональных групп повышающих генов по сравнению с распределением классов всех аннотированных изогрупп (критерий Колмогорова-Смирнова: P = 0,0001), что свидетельствует об обогащении конкретных функциональных классов поскольку уровни транскриптов гена GPC увеличиваются во время старения. В соответствии с ускоренным старением и повышенной транслокацией минералов, наблюдаемыми в присутствии экспрессии дикого типа GPC , мы наблюдали увеличение процентного содержания генов, участвующих в транспорте (GO:0006810), белковом метаболизме (GO:0019538) и катаболическом метаболизме. процессы (GO:0009056) и снижение доли генов, участвующих в процессе биосинтеза (GO:0009058) и организации и биогенезе клеточных компонентов (GO:0009628; таблица) среди изогрупп с повышающей регуляцией.

Мобильные элементы

Поиск сходства также проводился в базе данных TREP для выявления транскрибируемых мобильных элементов (избыточная база данных TREP; http://wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/). В общей сложности 748 изогрупп (5,1%) и 4010 синглетонов (2,5%) показали значительное сходство с мобильными элементами (BLASTN, E-значение < e -5 , дополнительный файл 1, таблица S6). Распределение различных надсемейств мобильных элементов в нашем наборе данных аналогично тому, которое наблюдается во всей базе данных EST пшеницы и в геномной ДНК пшеницы [39], причем Gypsy и Mariner являются наиболее распространенными элементами класса I и класса II соответственно. Среди экспрессируемых элементов 46 изогрупп и 29 синглетонов по-разному регулировались в двух генотипах в тестах edgeR и DESeq ( P ≤ 0,01; дополнительный файл 8). В обоих наборах данных количество повторяющихся элементов, уровень экспрессии которых повышается во время старения (87% среди изогрупп и 93% среди одиночек), значительно превышает количество повторяющихся элементов, активность которых снижается во время старения (13% среди изогрупп и 7% среди одиночек). Эти пропорции значительно отличались от случайного 50% распределения (X 2 тестов, P <0.0001).

Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что некоторые мобильные элементы активируются, возможно, посредством деактивации механизмов молчания [39] во время старения, что наблюдается в условиях биотических и абиотических стрессов [40-42]. Выявлены различия в распределении различных классов ретроэлементов между полным набором данных и подмножеством элементов, экспрессирующихся в процессе старения, как для изогруппы (критерий Колмогорова-Смирнова: P = 0,06), так и для синглетного набора (Колмогоров-Смирнов). Тест Смирнова: P = 0.02). Активированные повторяющиеся элементы показали обогащение элементов Gypsy в изогрупповом наборе и элементов Mariner в одиночном наборе.

Обсуждение

Монокарпическое старение характеризуется набором физиологических изменений, регулируемых развитием, включающим обширные изменения в экспрессии генов [21,22]. Эти изменения неразрывно связаны с ремобилизацией питательных веществ и углеводов из листьев в зерна, о чем свидетельствует одновременное изменение процессов старения и ремобилизации у изогенных линий с разными дозами активных генов GPC или у трансгенных РНКи-растений с разными GPC генами. уровней транскриптов [3].

Общий анализ экспрессии генов во время раннего старения

Основываясь на ранней повышающей регуляции GPC после цветения и замедленном старении растений GPC-RNAi [3], мы предположили, что этот транскрипционный фактор является ранним регулятором монокарпическое старение. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выбрали ранний момент времени после цветения, когда нет видимых фенотипических различий между растениями WT и GPC-RNAi (рис. ), но когда уровни транскриптов GPC значительно различаются между растениями WT и GPC-RNAi (рис. ).Снижение уровней транскриптов GPC на 35%, наблюдаемое через 12 дней после цветения в трансгенных растениях по сравнению с WT (рис. ), было связано с крупномасштабной дифференциальной экспрессией генов, затрагивающей примерно 5,5% изогрупп, включенных в это исследование (с использованием строгого ограничения). критерии). Большинство этих различий исчезают, когда одинаковые анализы были проведены между перетасованными группами, включая смеси образцов дикого типа и GPC-RNAi, что подтверждает существование реальных биологических различий.Тот факт, что различия в уровнях транскриптов GPC влияют на большое количество генов, также был отражен в кластерном анализе и анализе основных компонентов изогрупп (рис. ), одиночных генов и унигенов (рис. S5 и S6). Во всех анализах транскриптомы были разделены на две основные группы, определяемые генотипом GPC .

Поскольку подавление генов GPC оказывает множественное плейотропное воздействие на старение и ремобилизацию питательных веществ [3] и влияет на общее время процесса старения, возможно, что многие гены, дифференциально регулируемые в трансгенных растениях, будут также дифференцированно регулироваться между различными временными точками процесса старения у растений дикого типа. Однако в настоящее время мы не знаем, включают ли гены, затронутые подавлением РНКи генов GPC , полный набор генов, дифференциально регулируемых во время старения, или только их подмножество. Это будет зависеть от того, насколько рано ген GPC расположен в иерархии факторов транскрипции, координирующих реакцию старения, и от наличия регуляторных петель обратной связи, инициированных ниже GPC и активирующих более ранние этапы регуляции.

Анализ экспрессии шести выбранных кандидатов на протяжении периода раннего старения (рис. ) позволяет предположить, что выбранный момент времени для анализа mRNAseq (12 дней после цветения) дает хороший снимок транскрипционных изменений, связанных со снижением регуляции Ген GPC . На 2 DAA ни один из шести генов, проанализированных с помощью qRT-PCR на рисунке, не показал существенных различий в уровнях транскриптов. Наоборот, различия в уровне транскриптов на 22 DAA были больше для всех трех генов с повышенной экспрессией, но не были значительными для всех трех генов с отрицательной регуляцией, поскольку уровни их экспрессии в образцах WT и GPC-RNAi были снижены до аналогичных более низких уровней по сравнению с заголовком. дату к этому моменту времени (рис. ).Среди трех дополнительных подавленных генов, представленных в дополнительном файле 1 на рисунке S7, изогруппа 06043 также показала большие различия при 12 DAA по сравнению с 22 DAA, но оба различия были значительными. Таким образом, анализ, ограниченный 22 DAA, мог привести к недооценке количества генов с подавленной регуляцией. Кроме того, по мере старения первоначальные регуляторные эффекты гена GPC , вероятно, будут расширены другими факторами транскрипции, которые индуцируются в этот и более поздние моменты времени, что усложняет наш анализ.

Предыдущие подходы на основе микрочипов позволили получить исходную картину изменений транскриптома во время старения. Однако большинство этих исследований было проведено на двудольных видах [11,18-21,43,44], и лишь несколько таких исследований было проведено на злаках умеренного пояса [21,22]. Эти исследования привели к идентификации сотен генов, которые активируются по мере прогрессирования старения, в том числе с предполагаемой ролью в метаболизме и транслокации [38]. Однако использование микрочипов может быть ограничено, особенно при анализе относительно малоизученной стадии развития, такой как старение.

Сборка транскриптома De novo

В отличие от микрочипов, которые ограничены генами, напечатанными на чипах, mRNA-seq представляет собой открытую платформу, способную обнаруживать новые транскрипты, при условии, что они экспрессируются на уровнях, совместимых с секвенированием глубина. Это преимущество подхода mRNA-seq особенно ценно, учитывая ограниченную текущую информацию о последовательностях генов пшеницы, экспрессируемых во время старения, и отсутствие собранного генома пшеницы.Из 1 071 335 EST пшеницы, представленных в GenBank на момент проведения этого анализа, ни один не получен из флаговых листьев, собранных после цветения, и в базе данных Leaf Senescence присутствует только два аннотированных SAG пшеницы, один из которых представляет собой ген GPC [45]. .

Около 5% генов, собранных из последовательности 454 (исключая одиночные) (~1460 генов), не были обнаружены в коллекции EST пшеницы NCBI (BLASTN, E ≤ e -10 ), что позволяет предположить, что усилия по созданию сборка транскриптома de novo предоставила новую информацию. Возможно, что большая часть новых генов может быть идентифицирована на более поздних стадиях процесса старения. Ограниченная геномная информация, доступная для генов старения, также отражается небольшой долей транскриптов с повышенной экспрессией (10%; edgeR и DESeq P ≤ 0,01), которые мы смогли аннотировать с помощью GO Slim (на основе предполагаемых гомологов риса), когда по сравнению с долей аннотированных транскриптов с пониженной регуляцией (46%; edgeR и DESeq P ≤ 0,01).

Высокая доля прочтений из 454 циклов секвенирования (82.9%) были собраны в контиги с высоким значением N50 и средней длиной контигов 1216 п.н., что больше, чем сообщалось ранее, которые колеблются от 197 п.н. [46] до 500 п.н. [47]. Точность секвенирования и сборки была подтверждена поиском подобия BLAST как с точки зрения идентичности, так и длины выравнивания. Собранные стенограммы общедоступны через подразделение TSA GenBank, а синглтоны в виде файла с несколькими файлами Fasta в SOM (поскольку в подразделении TSA принимаются только собранные контиги).

Сборка транскриптома полиплоидных видов, таких как пшеница, создает дополнительные проблемы, которые не встречаются у диплоидных видов. Гомеологичные транскрипты трех геномов пшеницы идентичны примерно на 97% [48] и при используемых в данном исследовании параметрах сборки обычно сливаются в химерные контиги. Следовательно, при сопоставлении прочтений с контигами важно скорректировать количество несовпадений, чтобы допустить средние различия, вызванные расхождениями генома.В нашем случае мы картировали чтения с различиями до 3 нуклеотидов в среднем чтении 50 п.н., что приведет к включению чтений с идентичностью более 94%. Некоторые из некартированных прочтений могут представлять прочтения, которые более расходятся, чем геном, присутствующий в изогруппе, используемой в качестве эталона. Целью этого исследования была идентификация дифференциально регулируемых генов, поэтому разделение трех гомеологов пшеницы на отдельные контиги было сознательным решением. Будущие исследования, направленные на характеристику уровней транскриптов конкретных гомеологов, потребуют гораздо большего охвата и большей строгости для сбора контигов для различных гомеологических групп.

На основании наблюдаемых значений Ct в экспериментах с qRT-PCR собранный транскриптом включает гены с уровнями транскриптов всего 1/36 от уровней транскриптов ACTIN (например, изогруппа 12718). Несмотря на то, что мы получили 12-16 миллионов прочтений на образец, ~ 38% прочтений Illumina не были сопоставлены с 14 735 изогруппами. Приблизительно половина этих некартированных прочтений была впоследствии картирована с набором синглетонов (9,5%) или с набором UniGene GenBank пшеницы (9,2%, среди тех, которые не картированы с контигами или одиночками), подтверждая, что наши 454 контига представляют собой транскриптом, ограниченный экспрессируемыми генами. на относительно высоких уровнях.Среднее количество отсчетов, отображаемых на синглтоны, было на порядок ниже, чем количество отсчетов, отображаемых на собранные контиги (дополнительный файл 1, рисунок S3). Этот результат предполагает, что в среднем уровни транскриптов генов, включенных в одиночный набор данных, ниже, чем те, которые включены в собранные контиги. Остаточные некартированные чтения могут соответствовать генам, отсутствующим во всех трех наборах эталонных данных пшеницы, которые имеют более трех полиморфизмов с эталонной последовательностью (предел отсечки), или которые соответствуют загрязнению чужеродной ДНК и/или ошибкам секвенирования [49].

Сравнение BLASTX нашего набора данных из 815 дифференциально регулируемых генов с базой данных Leaf Senescence [45] показало значительное сходство (значение E<1 e -5 ) для 181 гена (24 повышающих и 157 понижающих регулируется). Этот результат предполагает, что дифференциально экспрессируемые гены, присутствующие в нашем наборе данных, включают как ядро ​​​​известных SAG, так и большой набор ранее не охарактеризованных SAG. Однако еще одна причина, по которой сходство могло не быть обнаружено, заключается в том, что почти 90% последовательностей, депонированных в базе данных старения листьев, относятся к двудольным видам.Только 9 % последовательностей относятся к рису и 1 % — к другим злакам [46], http://www. eplantsenescence.org/ по состоянию на 20 апреля th 2011). Таким образом, наш набор данных значительно расширяет число генов, потенциально играющих роль в регуляции старения у однодольных. Мы надеемся, что эти наборы данных станут полезным инструментом для исследовательских проектов, изучающих монокарпическое старение злаков.

Профилирование экспрессии генов путем секвенирования

Сравнение количества прочтений Illumina, картирующих конкретный ген в образцах дикого типа и трансгенных образцах GPC-RNAi, является хорошим индикатором относительных уровней его транскриптов [50].Справедливость этого подхода была подтверждена высокой корреляцией между нормализованным количеством Illumina и данными 454 и (рисунок) qRT-PCR (рисунок), а также разделением транскриптомов растений GPC-RNAi и WT на одни и те же два разных кластера. когда контиги, одиночные и единичные гены анализировались отдельно (рис. , S5 и S6). Из наших результатов видно, что уровень экспрессии и охват секвенированием являются важными факторами, определяющими точность измерения экспрессии генов, поскольку разница в количестве прочтений между библиотеками уменьшается по мере увеличения количества прочтений (рис. ).454 данные показали низкий охват, с небольшим количеством, особенно для генов с низким уровнем транскрипта, и большой вариацией между репликами. Напротив, точность, обеспечиваемая широким охватом секвенирования Illumina, привела к достаточной чувствительности для обнаружения значительных различий ( P ≤ 0,01 как в тестах edgeR, так и в тестах DESeq) для изменений экспрессии генов до 50%. Гены с низким уровнем экспрессии, как правило, трудно точно измерить, что приводит к низкой скорости проверки на разных платформах [51,52].

Платформы Illumina и qRT-PCR имеют разные сильные и слабые стороны. qRT-PCR обеспечивает чувствительность для обнаружения генов с очень низким уровнем экспрессии, что потребовало бы чрезвычайно глубокого секвенирования Illumina, но имеет ограниченную мощность для обнаружения различий менее чем в 2 раза, если только не используется большое количество биологических повторов (> 10 для некоторых коэффициентов вариации, наблюдаемых в нашем исследовании). Напротив, секвенирование Illumina способно обнаруживать небольшие различия в экспрессии, но ему не хватает чувствительности для обнаружения генов с очень низким уровнем транскрипта (если только не используется очень глубокое покрытие).Относительно низкая мощность qRT-PCR для обнаружения различий, близких к 2-кратным (только 41% проверенных генов), отражается в улучшении доли значимых различий в тесте qRT-PCR, наблюдаемом, когда сравнения были ограничены генами с более чем 2,5 кратные различия в уровнях транскриптов (64% подтвержденных генов). Однако высокая корреляция между qRT-PCR и соотношением уровней транскриптов Illumina между генотипами ( R = 0,83, рисунок) предполагает, что между двумя наборами данных существует значительное сходство.

Время и стоимость проверки генов по отдельности с помощью qRT-PCR вместе с ее относительно низкой мощностью по сравнению с новыми технологиями секвенирования мРНК, вероятно, приведут к постепенной замене qRT-PCR в качестве золотого стандарта для проверки глобальных исследований экспрессии . Мы предполагаем, что анализ последовательностей мРНК транскриптомов следующего поколения в независимых экспериментах с использованием различных генетических групп станет более эффективной стратегией одновременной проверки сотен дифференциально регулируемых генов.По мере того, как подходы к секвенированию следующего поколения становятся все более доступными, а технологии и инструменты анализа данных совершенствуются, повторные эксперименты по секвенированию мРНК, вероятно, станут общей стратегией проверки.

Биологическое значение

генов, регулируемых GPC

Список предполагаемых генов, регулируемых GPC , полученный в этом исследовании, обеспечивает ценную отправную точку для анализа путей, регулирующих старение и транслокацию питательных веществ в пшенице. Однако отсутствие функциональной информации для большой части дифференциально регулируемых транскриптов ограничивает нашу способность выполнять более полный биоинформатический анализ биохимических и сигнальных путей, дифференциально регулируемых во время старения. Из-за этого ограничения следующее обсуждение сосредоточено на вариациях относительных пропорций нескольких функциональных категорий и на более детальном изучении нескольких генов, которые представляют собой примеры генов с повышающей и понижающей регуляцией в различных функциональных категориях.

Изогруппы с пониженной экспрессией составляют 70% всех дифференциально регулируемых генов (рис. ) и, вероятно, включают гены, кодирующие процессы, которые больше не требуются на этой последней стадии развития растения.В нашем наборе данных это проявляется в крупномасштабном подавлении сигнальных компонентов (таблица), включая ассоциированные со стенкой киназы (WAK), некоторые члены которых подавляются (прямо или косвенно) GPC (например, изогруппы 14599 и 13361, (DEseq P ≤0,01, Edge R P ≤0,01 и MWW P ≤0,05, дополнительный файл 3).Кроме того, GPC может играть активную роль в отключении процессов фотосинтеза на ранних стадиях старения. на что указывает пониженная регуляция нескольких генов, кодирующих компоненты фотосинтетического аппарата, в образцах WT (более высокие уровни GPC) по сравнению с GPC-RNAi. Гены с пониженной экспрессией включают гены, кодирующие малую субъединицу Rubisco (изогруппа 01798, MWW P ≤0,05, дополнительный файл 3), и по крайней мере восемь предполагаемых генов, кодирующих связывание хлорофилла a/b (белок CAB), хорошо охарактеризованный ген. тесно связаны с началом старения (например, изогруппы 11346, 11739 и 11151 (DEseq P ≤0,01, Edge R P ≤0,01 и MWW P ≤0,05) Дополнительный файл 3; [53,54]). Обнаружение того, что фактор транскрипции NAC также значительно подавляется по мере увеличения экспрессии GPC (изогруппа 10940, рисунок ), показывает, что дифференциальная регуляция транскрипции у разных членов семейства NAC может играть разные роли по мере того, как растение переходит в старение.

Напротив, гены, которые активируются во время старения, вероятно, включают те, которые играют активную роль в начале старения и активации транспортных сетей, необходимых для повторной мобилизации питательных веществ в зерно, и, таким образом, представляют больший биологический интерес для повысить пищевую ценность зерна. Среди генов, наиболее активизированных в этом исследовании, находится ген, кодирующий JA-индуцированный жакалин-подобный лектиновый доменный белок (изогруппа 08662, рис. ). Уровни транскрипта этого гена почти не обнаруживаются при 2 DAA, и только по мере увеличения экспрессии GPC его экспрессия индуцируется.Различия в уровнях транскриптов этого гена между растениями WT и GPC-RNAi увеличились с 12 до 22 DAA (рис. 1), что соответствует результатам, наблюдаемым для транскриптов GPC (рис. 1). Было показано, что жасмоновая кислота вызывает старение листьев у Arabidopsis [10], а некоторые гены биосинтеза JA активируются во время старения [53]. JA-чувствительные SAG были идентифицированы в независимых исследованиях микрочипов [55-57], включая несколько генов в семействе генов жакалинового лектина. Сильная активация этого гена с помощью GPC в дополнение к значительно активируемому JA-индуцируемому белку (изогруппа 09977, edgeR и DESeq P ≤ 0.01, MWW <0,05, дополнительный файл 3) предполагает, что ЖАК может играть важную роль в начале старения пшеницы.

Гормон ABA также играет хорошо задокументированную роль в индукции старения у других видов растений [8,13]. Наше обнаружение того, что предполагаемый белок, индуцируемый АБК, является одним из генов с наиболее высокой активацией (изогруппа 10136, рис. 1), показывает, что гены, индуцируемые этим гормоном, также могут быть вовлечены в индукцию и прогрессирование старения у пшеницы. Как и в случае с другими генами с повышенной экспрессией, уровни транскриптов увеличиваются на 12 DAA и далее в соответствии с увеличением экспрессии GPC .Более тщательное функциональное изучение этих генов пшеницы может дать новое представление о роли, которую играют JA и ABA во время монокарпического старения, и об их взаимодействии с генами GPC .

Увеличение экспрессии GPC также связано с увеличением скорости транслокации и более эффективной ремобилизацией нескольких важных микроэлементов в развивающееся зерно [3,29]. Поскольку большая часть питательных веществ, обнаруженных в зерне, возникает в результате разрушения компонентов клеток листа во время старения [58], одним из возможных объяснений улучшенной ремобилизации является более быстрый и полный распад сложных молекул листа, что приводит к общему увеличению концентрация более простых молекул, готовых к транспортировке. В соответствии с этим наша аннотация генной онтологии выявила обогащение генов, участвующих в метаболизме белков и каталитических процессах, среди тех, которые значительно активировались (таблица).

Исследования с использованием парового пояса для индукции старения листьев ячменя показали важную роль протеаз в регуляции этого клеточного распада, особенно протеаз класса цистеина [59,60]. Поиск TBLASTN (значение E ≤ e -10 ) с использованием всех охарактеризованных протеаз ячменя против наших наборов изогрупп, синглетонов и унигенов дал 150, 107 и 149 протеаз пшеницы, соответственно (данные не показаны).Среди этих 406 протеаз только семь имеют гомологи в унигенной сборке ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»CK209601″,»term_id»:»39571991″,»term_text»:» CK209601″}}CK209601, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CK194339″,»term_id»:»39556729″,»term_text»:»CK194339″}}CK194339, { «type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CA646317″,»term_id»:»25224613″,»term_text»:»CA646317″}}CA646317, {«type»:»entrez- нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CK218017″,»term_id»:»39624121″,»term_text»:»CK218017″}}CK218017, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»: {«text»:»CK214606″,»term_id»:»39620710″,»term_text»:»CK214606″}}CK214606, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CK205578 «,»term_id»:»39567968″,»term_text»:»CK205578″}}CK205578, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CK167111″,»term_id»:» 3

55″,»term_text»:»CK167111″}}CK167111; Дополнительный файл 5) продемонстрировал значительную активацию WT по сравнению с образцами GPC-RNAi (DEseq P ≤0. 01, Edge R P ≤0,01 и MWW P ≤0,05). Одним из возможных объяснений относительно ограниченной повышающей регуляции протеаз в нашем наборе данных могут быть различия в экспериментальных подходах (естественно индуцированное монокарпическое старение по сравнению с индуцированным паровым опоясыванием старением). В качестве альтернативы возможно, что GPC играет ограниченную роль в повышающей регуляции протеаз и что при 12 DAA гены, кодирующие другие протеазы, еще не регулируются дифференцированно. Поскольку видимые признаки старения в листьях все еще отсутствуют даже при 22 DAA (дополнительный файл 1, рисунок S1), клеточная деградация и метаболизм, опосредованные протеазами, могут просто происходить на более поздней стадии старения и, следовательно, не поддаются нашему обнаружению.

Очевидным способом увеличения ремобилизации питательных веществ является усиление экспрессии или активности генов-транспортеров, ответственных за транспорт питательных веществ к зерну. Например, сверхэкспрессия гена, кодирующего член транспортеров ZIP, в ячмене приводила к повышению уровня цинка в развивающемся зерне [61]. В наших данных транскриптома имеется большая доля генов с транспортной активностью среди генов, регулируемых GPC, чем среди генов, регулируемых GPC или не затронутых GPC (таблица).Транспортеры с повышенной экспрессией включают одного члена семейства NRAMP (изогруппа 01654, MWW P ≤0,05, дополнительный файл 3) и одного из семейства генов ZIP (изогруппа 02825, MWW P ≤0,05, дополнительный файл 3). Было показано, что белки NRAMP в растениях действуют как переносчики нескольких двухвалентных катионов металлов, принимая ионы, включая железо [62], алюминий [63] и кадмий [64]. У растений семейство транспортеров ZIP было хорошо охарактеризовано как транспортеры ионов металлов, и было показано, что некоторые члены активируются во время старения [53].

Согласно аннотации риса, некоторые гены семейства нодулинов значительно активируются во время старения пшеницы. Член этого семейства с наиболее высокой активацией относится к классу нодулина MtN3, который значительно активируется в WT по сравнению с GPC-RNAi при 12 DAA и еще больше увеличивается при 22 DAA (изогруппа 10811, рис. ). Было показано, что близкий гомолог в рисе взаимодействует с двумя переносчиками Cu (COPT) [65,66], что указывает на возможность того, что гомологичные гены, идентифицированные в нашем скрининге, могут играть аналогичную роль в ремобилизации питательных веществ во время старения.Дополнительные эксперименты потребуются для выяснения роли клубеньков пшеницы во время монокарпического старения.

Хотя подход, описанный в этом исследовании, предоставляет начальный список дифференциально экспрессируемых генов для анализа ранних стадий старения, регулируемого ГПК, в настоящее время мы не можем провести различие между теми генами, которые напрямую регулируются ГПК, и теми, которые регулируются косвенно через промежуточные гены. . Для решения этого вопроса потребуются эксперименты по иммунопреципитации хроматина, дополненные in vitro идентификацией ДНК-связывающих последовательностей, специфичных для GPC [67,68].

Методы

Растительный материал и экстракция РНК

Трансгенные растения для конструкции GPC-RNAi ( T. aestivum cv. Bobwhite) и контроли дикого типа [3] выращивали в условиях длинного дня (16 ч свет 8 ч темно). Через 12 дней после цветения (12 DAA) отбирали образцы цельных флаговых листьев и немедленно замораживали в жидком азоте. Один и тот же растительный материал использовали для создания библиотеки и проверки qRT-PCR с использованием четырех независимых биологических повторов для создания библиотеки и в общей сложности десяти биологических повторов для экспериментов по валидации qRT-PCR.Листья измельчали ​​и образцы РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Концентрацию и чистоту тотальной РНК проверяли на спектрофотометре Nanodrop. Целостность РНК оценивали с помощью стандартного электрофореза в формальдегид-агарозном геле.

454 Секвенирование мРНК

Секвенирование полноразмерных библиотек кДНК выполняли с использованием секвенатора GS FLX (Roche) в Объединенном центре геномики Университета штата Канзас в соответствии со стандартным протоколом секвенирования с однократным считыванием 454 с применением титановой химии (Roche). Синтез кДНК первой цепи проводили по технологии синтеза кДНК SMART (Clontech Laboratories, Inc.) с использованием модифицированного 3′-праймера SMART CDS Primer II A (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTGT(9)CT(10)VN-3′) и реверсивного SuperScript III. транскриптазы (Invitrogen). Двухцепочечную кДНК амплифицировали с помощью дальней (LD) ПЦР с использованием ферментной системы Advantage 2 PCR (Clontech Laboratories, Inc). Амплификацию проводили на термоциклере (Applied Biosystem) при следующих параметрах ПЦР: 95°С — 1 мин.затем 16 циклов 95°С — 15 сек, 65°С — 30 сек, 68°С — 6 мин. Качество двухцепочечной кДНК проверяли, пропуская гель 1,1% агарозы/EtBr в 1X буфере TAE, и очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (QIAGEN).

Сборку последовательности кДНК и обрезку адаптеров, используемых для создания библиотеки, выполняли с использованием GS Assembler (Roche) с параметрами по умолчанию для обнаружения перекрывания. Эти параметры включают минимальное перекрытие 40 п.н. и минимальную идентичность перекрытия 90%. Поскольку кодирующие области генома пшеницы A, B и D идентичны примерно на 97% [48], представленные здесь 454 контига, вероятно, включают комбинации различных гомеологов, а также внутригеномных паралогов. Прочтения, идентифицированные GS De Novo Assembler как выбросы, и прочтения короче 50 нуклеотидов после обрезки были исключены из процесса сборки.

Число 454 операций чтения в каждой изогруппе было подсчитано с использованием пользовательского сценария PERL с использованием данных в файле ACE, сгенерированном ассемблерным модулем GS De Novo.Сборки депонированы в GenBank (подразделение TSA) под номерами доступа {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»HP608076″,»term_id»:»312460807″,»term_text»:»HP608076″ }}HP608076 — {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»HP639668″,»term_id»:»3124

«,»term_text»:»HP639668″}}HP639668 (проект TSA 59945 ;дополнительный файл 2). Анализы BLAST выполнялись локально с использованием BLAST 2.2.21 (NCBI).

Секвенирование мРНК Illumina

Синтез амплифицированной кДНК выполняли в соответствии с протоколом секвенирования мРНК от Illumina (№ по каталогу 1004898 Rev. D) и с использованием 10 мкг тотальной РНК в качестве исходного материала. Начальный целевой размер вставки варьировался от 150 до 250 п.н., но более короткие фрагменты были включены в процессе очистки, как это отражено в последующем анализе последовательности. Секвенирование проводили на анализаторе генома Illumina II в ядре службы ДНК-технологий в Калифорнийском университете в Дэвисе (http://genomecenter.ucdavis.edu). Секвенирование одного парного конца проводили с использованием 85 циклов. Основной вывод конвейера Illumina (файлы qseq) использовался для извлечения последовательностей высокого качества.Анализатор http://code.google.com/p/atgc-illumina/wiki/Illumina_QSEQ_Parser проанализировал показатели качества в файлах qseq и обрезал все после первой неудачной оценки «B» (см. http://code.google. com/p/atgc-illumina/wiki/Illumina_Quality_Scores). После обрезки мы отфильтровывали последовательности короче 40 н., а также те, в которых содержание GC не находилось в диапазоне 20–80 %. Файлы FASTA с обрезанными последовательностями высокого качества использовались для последующего анализа. Последовательности низкого качества и загрязнители векторов/адаптеров удаляли с помощью пользовательских сценариев, доступных на сайте http://code.google.com/p/atgc-illumina/. Чтения Illumina были депонированы в Омнибусе экспрессии генов Национального центра биотехнологической информации (GEO) и доступны через GEO (номер доступа. {«type»:»entrez-geo»,»attrs»:{«text»:»GSM632785″ ,»term_id»:»632785″}}GSM632785-91; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc={«type»:»entrez-geo»,» attrs»:{«текст»:»GSE25759″,»term_id»:»25759″}}GSE25759).

Чтения высокого качества были сопоставлены с 454 сборками, синглтонами и унигенами (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID=4565), используя режим глобального выравнивания Bowtie V0.12.5 [32] и допуская максимум три несоответствия (параметры: -k 1 —best -v 3 -f — сэм — сэм-безголовый). Результаты были подтверждены с помощью SOAPaligner/SOAP2 [70]. Выходные файлы SAM анализировались с помощью пользовательских сценариев Perl для подсчета количества операций чтения, сопоставленных с одним contig/isotig. Прочтения, совпадающие с изотигами и контигами в изогруппах, суммировали для получения подсчетов по изогруппам. Нормализованные по изогруппе количества трансгенных растений дикого типа и GPC-RNAi сравнивали с использованием как статистического анализа DESeq [33], так и статистического анализа edgeR [34].Обе программы предполагают отрицательное биномиальное распределение для данных подсчета, но отличаются своими моделями оценки параметров распределения по данным. В частности, edgeR использует однозначную оценку дисперсии дисперсии, тогда как DESeq оценивает дисперсию локально, используя разные коэффициенты вариации для разных уровней экспрессии, предполагая, что гены с одинаковым уровнем экспрессии также имеют аналогичную дисперсию в репликах (подробности см. 33] и [34]).

qRT-PCR

Последовательность из каждой целевой изогруппы использовали для скрининга доступной базы данных NCBI EST пшеницы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Праймеры были разработаны с использованием программного обеспечения Primer3 (http://frodo. wi.mit.edu/primer3/) на основе последовательности изогрупп или, если они доступны, на консенсусных последовательностях из EST или контигов из разных геномов пшеницы. Следовательно, представленные здесь профили транскрипции представляют собой интеграцию уровней транскриптов различных гомеологов каждого гена. Эффективность праймеров рассчитывали с использованием пяти 4-кратных разведений кДНК (1:1, 1:4, 1:16, 1:64 и 1:256) в повторах, а также проверяли амплификацию в отрицательном контроле без ДНК.Эффективность праймеров, использованных в этом исследовании, варьировалась от 86,8% до 99,5% (дополнительный файл 1, таблица S4). Специфичность проверяли анализом кривых диссоциации в диапазоне от 60°С до 94°С. Ранее были описаны праймеры для внутреннего контроля ( ACTIN ) и консервативные праймеры, которые амплифицируют все паралогичные и гомеологичные гены GPC в области вне конструкции РНКи [3]. Копия GPC-6B удалена в Bobwhite [3].

РНК-эквивалент 1 мкг кДНК был синтезирован с использованием набора для синтеза кДНК QuantiTect (QIAGEN) и образцов, разведенных до 10 нг/мкл. Реакции qRT-PCR включали 1 мкл кДНК, соответствующей 10 нг общей РНК, 10 мкл смеси QuantiTect SYBR Green PCR (QIAGEN), 0,5 мкл прямого и обратного праймеров (10 мкМ, конечная концентрация 250 нМ) и 4 мкл воды в конечный реакционный объем 20 мкл. Реакции qRT-PCR проводили с использованием системы обнаружения последовательности ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) при следующих условиях циклирования: 50°C — 2 мин, 95°C — 15 мин, 40 циклов 95°C — 15 сек, 60 циклов. °С — 1 мин. Для каждой валидации использовали 10 биологических повторов для каждого генотипа.Метод 2 -ΔΔ C t [36] использовали для нормализации и калибровки значений транскрипта относительно эндогенного контроля ACTIN . В рамках анализа для всех генов использовался один и тот же калибратор, поэтому шкалы их линеаризованных значений сопоставимы. Эти линеаризованные значения представляют количество копий РНК на копию в образце калибратора.

Дополнительный материал

Дополнительный файл 1:

Рисунок S1 — Растения WT и GPC-RNAi через 22 дня после цветения. Рисунок S2 — Частотное распределение длин 454 прочтений (A) и собранных транскриптов (B). Рисунок S3 — Относительное распределение охвата подсчетов данных 454 и Illumina (контиги и одиночки). Рисунок S4 — Блок-диаграммы, показывающие распределение необработанных (слева) и нормализованных (справа) значений Illumina. Рисунок S5 — Кластеризация образцов на основе подсчета прочтений Illumina, сопоставленных с одиночными (слева) и одногенными (справа). Рисунок S6 — Анализ основных компонентов данных Illumina. Рисунок S7 — Уровни транскриптов изогрупп, подтвержденные количественной RT-ПЦР (таблица P ≤0,05) и не включенные в рисунок в зависимости от времени старения. Таблица S1 — сводка результатов 454 секвенирования. Таблица S2 — сводка результатов секвенирования Illumina. Таблица S3 — сводка по подсчетам считываний Illumina. Таблица S4 — Изогруппы, проанализированные с помощью qRT-PCR, гомеологи, последовательности праймеров и эффективность праймеров. Таблица S5 — Процентное распределение функциональной группировки синглетонов на основе аннотации GO-slim. Таблица S6 — Обилие мобильных элементов в собранном транскриптоме и в одиночных клетках и их дифференциальная экспрессия в флаговых листьях WT и GPC-RNAi.

Дополнительный файл 2:

Мультифаст-файл с последовательностями из 146 671 одиночек .

Дополнительный файл 3:

Нормализованное количество прочтений Illumina, сопоставленное с 454 контигами, с вычисленными P-значениями для статистического анализа MWW, edgeR и DESeq . В таблицу также включены идентификаторы изотигов и контигов с соответствующим инвентарным номером GenBank и соответствующими терминами GOSlim.Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0,01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05.

Дополнительный файл 4:

Нормализованное количество прочтений Illumina, сопоставленное с 454 синглтонами, с рассчитанными значениями P- для статистического анализа MWW, edgeR и DESeq . Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0.01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05.

Дополнительный файл 5:

Нормализованное количество прочтений Illumina, картированных на unigenes пшеницы, с рассчитанными значениями P- для MWW, edgeR и DESeq . Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0,01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05.

Дополнительный файл 6:

Набор из 815 изогрупп, дифференциально регулируемых в тестах edgeR и DESeq ( P ≤0.01) . Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0,01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05. Данные отсортированы по кратному изменению.

Дополнительный файл 7:

Набор из 691 изогруппы, дифференциально регулируемой в тестах edgeR ( P ≤0,01) DESeq ( P ≤0,01) и MWW ( P ≤0,08) 2 теста. Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0.01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05. Данные отсортированы по кратному изменению.

Доп. файл 8:

Набор из 748 изогрупп, подобных подвижным элементам . Цветовое кодирование клеток: красный цвет соответствует ≥2-кратной повышающей регуляции, зеленый цвет соответствует ≥2-кратной понижающей регуляции, желтый цвет соответствует P ≤0,01, а оранжевый цвет соответствует P ≤0,05.

Границы | Экспрессия, регуляция и биомаркерный потенциал глипикана-1 при раке

Введение

Являясь второй основной причиной смерти человека, рак по-прежнему остается серьезной проблемой здравоохранения в мире (1).Исследования выявили основные онкогенные сигнальные пути, включая клеточный цикл, модификацию гистонов, апоптоз и другие биологические процессы и клеточные пути (2, 3). Хотя они чрезвычайно важны для понимания развития рака, большинство этих компонентов пути располагаются внутриклеточно, что делает их неэффективно доступными терапевтическими мишенями и не делает их идеальными для обнаружения клинических биомаркеров.

Все больше признается роль внеклеточных сигналов в развитии рака, при котором они могут значительно модулировать признаки рака (4–6).Гепарансульфатные протеогликаны (HSPG), которые в основном находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе, привлекли значительный научный интерес (7–9). Они становятся новой темой исследований в области рака (10, 11).

Glypicans — одно из семейств HSPG. Эти связанные с мембраной белки участвуют в развитии органов, модулируя внеклеточные сигналы роста и формирование градиента морфогена, и участвуют в проблемах избыточного роста и дисплазии скелета у человека (12). При некоторых видах рака они сильно выражены, связаны с онкогенезом и регулируют ангиогенез для прогрессирования и инвазии рака (13, 14).Их причинная роль в онкогенезе подтверждается генетическими данными (15).

Как и другие глипиканы, недавно было обнаружено, что Glypican-1 (GPC-1) сверхэкспрессируется при некоторых видах рака и участвует в онкогенезе некоторых видов рака (16, 17). Важно отметить, что в некоторых исследованиях сообщалось о повышении его уровня в периферической крови пациентов, что дает большие надежды в качестве нового биомаркера глипиканов в области рака (8, 18).

Гепарансульфат Протеогликаны, глипиканы и GPC-1

HSPG представляют собой гликозилированные белки, состоящие из основного белка с одной или несколькими ковалентно присоединенными цепями гликозаминогликанов (GAG).ГАГ представляют собой линейные тандемные повторы дисахаридных единиц, которые состоят из аминосахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина) вместе с уроновым сахаром (глюкуроновой кислотой или идуроновой кислотой) или галактозой. В настоящее время обнаружено шесть ГАГ: гепарин (ГП) и гепарансульфат (ГС), хондроитинсульфат (ХС), дерматансульфат (ДС), кератансульфат (КС) и гиалуроновая кислота (ГК) с различными амино- и уроновыми сахарами. в их дисахаридных единицах (19). За исключением HP и HA, которые секретируются в свободной форме без ковалентного связывания с какими-либо белками, остальные четыре GAG связаны с коровым белком в остатке Ser дипептидной последовательности Ser-Gly с образованием протеогликана (20).HSPG широко представлены на клеточных мембранах и во внеклеточном матриксе, в зависимости от структуры и тканевой экспрессии их основных белков. HSPG обычно подразделяют на три основных класса: глицерофосфатидилинозитидный (GPI) тип, заякоренный на поверхности мембраны (например, глипикан), трансмембранный тип (например, синдекан) и тип внеклеточного матрикса (например, агрин и перлекан) (21). HSPG действуют как корецепторы для передачи сигнала, играя важную роль в росте клеток, иммунном ответе, онкогенезе и т. д.(10, 22, 23).

Glypicans являются одним из семейств HSPG, включая глипикан-1 (GPC-1) до -6 (GPC-6) у млекопитающих с основным отличием в количестве цепей HS и сайте прикрепления белка. Эти белки расположены на клеточной мембране и закреплены гликозилфосфатидилинозитолом (GPI), который расщепляется липазой Notum (24). Глипиканы имеют решающее значение для роста раковых клеток, метастазирования и ангиогенеза многих типов раковых клеток человека (13, 15). Аномальная экспрессия глипиканов была отмечена при множественных типах рака.Например, GPC-3 тесно связан с возникновением и развитием опухолей, таких как гепатоцеллюлярная карцинома человека, рак яичников и меланома (25–27). GPC-2 связан с нейробластомой (28, 29).

GPC-1 состоит из белка (558 аминокислот) с присоединением трех цепей HS в положениях S486, S488 и S490 соответственно. Он имеет как заякоренную в мембране форму (по GPI на S530), так и секретируемую растворимую форму (30). Его также можно расколоть с помощью Notum (14, 31). GPC-1 в основном экспрессируется в центральной нервной системе и скелетной системе во время эмбрионального развития и экспрессируется в большинстве тканей у взрослых (32).Подобно другим HSPG и глипиканам, GPC-1 функционирует за счет связывания факторов роста, цитокинов, ферментов, вирусных белков и других факторов своими боковыми цепями HS. Он участвует в нейродегенерации и развитии рака (33–36).

Экспрессия GPC-1 при раке

Исследования показали, что GPC-1 аномально экспрессируется в различных опухолевых тканях и связан с развитием рака. Более ранние исследования использовали нозерн-блоттинг и иммуногистохимию и обнаружили, что уровни экспрессии мРНК и белка GPC-1 были повышены в поджелудочной железе с раком по сравнению с нормальным контролем и поджелудочной железой с хроническим панкреатитом (37).Это было дополнительно подтверждено Kayed et al. которые использовали количественную ПЦР, и было показано, что GPC-1 в основном локализуется в раковых клетках поджелудочной железы и прилегающих фибробластах (38). Более того, экспрессия GPC-1 в значительной степени коррелировала с патологическими стадиями и клиническими стадиями рака поджелудочной железы и тесно связана с неблагоприятным прогнозом для пациентов (39).

Повышенная экспрессия GPC-1, но не других глипиканов, была также обнаружена в культивируемых клеточных линиях рака поджелудочной железы (16).В этом исследовании нокдаун экспрессии GPC-1 в клетках ингибировал митотический ответ на фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), что свидетельствует о том, что GPC-1 может играть важную роль в инициации и прогрессировании рака поджелудочной железы.

Экспрессия

GPC-1 была также увеличена в тканях рака молочной железы (17), злокачественных опухолях яичников (40), раковых эпителиальных клетках предстательной железы (41). Более того, 98,8% тканей рака пищевода продемонстрировали сверхэкспрессию GPC-1 и ее связь с неблагоприятным прогнозом (42).Однако экспрессия GPC-1 при колоректальном раке была спорной. Фернандес-Вега и др. сообщили, что уровни экспрессии как мРНК GPC-1, так и белка были повышены при колоректальном раке (43), в то время как De Robertis et al. обнаружили, что мРНК GPC-1 была снижена в тканях метастатического колоректального рака и неметастазирующего колоректального рака (44).

Возможные механизмы экспрессии GPC-1 при раке могут включать экспрессию микроРНК и гипометилирование ДНК. Обычно микроРНК-96-5p и микроРНК-149 связываются с областью 3′-UTR транскрипта GPC-1, подавляя ее экспрессию.Однако экспрессия этих двух микроРНК часто снижена при раке поджелудочной железы (45). Кроме того, две важные регуляторные молекулы, KRAS и экотропный сайт интеграции вируса 1 (EVI1), являются двумя известными факторами канцерогенеза поджелудочной железы. Оба они могут усиливать экспрессию GPC-1, при этом EVI1 подавляет экспрессию микроРНК-96 (46). Другим важным механизмом является гипометилирование промотора, происходящее в гене GPC-1 при аденокарциноме протоков поджелудочной железы, при которой уровни мРНК и белка GPC-1 значительно повышены (16).

Сигнализация GPC-1 при раке

Glypicans опосредуют передачу сигналов при клеточной пролиферации, дифференцировке и развитии органов путем взаимодействия с рецепторами клеточной мембраны через боковые цепи HS, включая Wnt/β-катенин, Hedgehog (Hh), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и т. д. (13, 15). Механизм действия GPC-1 хорошо иллюстрируется сигнальным путем FGF-2. Связываясь с цепями HS GPC-1, FGF-2 и его рецептор FGFR более эффективно собираются и стабилизируются, а лиганд FGF-2 защищается от деградации.Кроме того, участие GPC-1 в сборке также способствует димеризации FGFR, что приводит к ускоренному самофосфорилированию, что инициирует передачу сигнала в протеинкиназе B (PKB), митоген-активируемой протеинкиназе (MAPK) и других клеточных сигнальные пути (47, 48).

Измененная клеточная активность и биологические процессы, вызванные GPC-1, могут быть связаны с модуляцией передачи сигналов FGF-2, хорошо известного пути регуляции клеточного роста, выживания, дифференцировки и неоваскуляризации, онкогенеза (49, 50) .Цяо и др. показали, что экспрессия GPC-1 усиливала рост эндотелиальных клеток головного мозга и повышала их чувствительность к митогенезу, индуцированному FGF-2. Сверхэкспрессия glypican-1 приводила к усилению ангиогенеза и резистентности к облучению в глиомах головного мозга (51). Интересно, что GPC-1 повышал уровень микроРНК-149 за счет активации FGFR1, и эта микроРНК, в свою очередь, подавляла другие нижестоящие регуляторы FGFR1. Эта петля отрицательной обратной связи снижала реакцию эндотелиальных клеток на ангиогенный стимул FGF (52).Хотя GPC-1 положительно участвует в передаче сигналов FGFR, этому эффекту может противодействовать его растворимая форма, секретируемая во внеклеточное пространство (23).

GPC-1 не только регулирует FGF-2, но также модулирует передачу сигналов VEGF-A. VEGF является ключевым фактором ангиогенеза, одного из важнейших биологических процессов онкогенеза (53). Как VEGF-A, так и FGF-2 представляют собой тип связывающих гепарин факторов роста (HBGF), мощность и продолжительность передачи которых могут регулироваться с помощью GPC-1 (54). Обе их передачи сигналов были ингибированы после того, как GPC-1 был нокдаун в мышиной модели рака поджелудочной железы (55).Более того, эндотелиальные клетки печени, выделенные от мышей, лишенных GPC-1, продемонстрировали ослабленный митогенный ответ на VEGF-A (56).

Кроме того, GPC-1 также модулирует сигнальный путь TGF-β (рис. 1). Сигнальный путь TGF-β участвует в инициации и прогрессировании опухоли, регулируя клеточную пролиферацию, ангиогенез, стволовость раковых клеток, эпителиально-мезенхимальный переход, инвазию и воспаление (57). Здесь GPC-1 также взаимодействует с лигандом и рецептором, способствуя передаче сигналов TGF-β.Снижение экспрессии GPC-1 ослабляло индуцированное TGF-β1 ингибирование роста клеток с подавлением фосфорилирования Smad2 и активности промотора ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) в раковых клетках поджелудочной железы (58). Кайед и др. более тщательно проанализировали роль GPC-1 в передаче сигналов TGF-β и обнаружили, что снижение GPC-1 приводит к смещению ответа на TGF-β, активин-A и костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) при Индукция p21 и фосфорилирование Smad2, что приводит к ингибированию роста клеток рака поджелудочной железы (38).

Рисунок 1 . GPC-1 модулирует сигнальные пути при прогрессировании рака. Боковые цепи HS GPC-1 связывают как факторы роста (такие как VEGF-A, FGF-2 и TGF-β), так и их рецепторы, чтобы облегчить их сборку для усиления передачи сигналов в путях PI3K/AKT, MAPK, Smad. GPC-1 может расщепляться Notum и затем высвобождаться во внеклеточное пространство, где он может конкурировать с GPC-1, закрепленным на клеточной мембране, ингибируя его функцию.

GPC-1 как клинический биомаркер рака

Поскольку GPC-1, заякоренный на клеточной мембране, расщепляется, а также имеет секретируемую растворимую форму, он обнаруживается в системе периферической крови, что побудило провести обширные исследования его потенциала в качестве клинического биомаркера.В 2015 г. из 48 белков, идентифицированных в экзосомах раковой ткани с помощью масс-спектрометрии и биоинформатического анализа, Melo et al. впервые сообщили, что GPC-1 можно использовать в качестве маркера рака поджелудочной железы. Впоследствии сообщалось об обнаружении GPC-1 в экзосомах сыворотки крови человека. У пациентов с раком молочной железы у 75% было более высокое количество экзосом GPC-1 + , чем у здоровых людей. При аденокарциноме протоков поджелудочной железы (PDAC) все 190 образцов сыворотки пациентов имели более высокие экзосомы GPC-1 + , чем у здоровых людей, демонстрируя почти идеальное диагностическое значение (~ 100 и ~ 100% на кривой рабочей характеристики приемника).С помощью многофакторного регрессионного анализа Кокса это исследование также показало, что экзосомы GPC-1 в сыворотке были независимым прогностическим маркером выживаемости, специфичной для заболевания (59).

Имеются также другие отчеты, в которых использовались различные методологии для оценки диагностического потенциала GPC-1 при раке. Цянь и др. выделили сывороточные внеклеточные везикулы (EV) и обнаружили, что GPC-1 + EVs был значительно выше у пациентов с распространенным раком поджелудочной железы, чем у здоровых людей (60).Льюис и др. разработали иммуноанализ с аффинным захватом и элюцией для обнаружения экзосомального GPC-1, который отличал 20 образцов пациентов с PDAC от 11 здоровых субъектов с чувствительностью 99% и специфичностью 82% (18). Ян и др. использовали расширенный мультиплексный плазмонный анализ и определили сигнатуру GPC-1 и других четырех маркеров для обнаружения PDAC, в которых диагностическая чувствительность и специфичность только GPC-1 достигли 82 и 52% соответственно (61).

Потенциал биомаркера циркулирующего GPC-1 также изучался при других видах рака.Процент экзосом GPC-1 + в плазме значительно увеличился у пациентов с колоректальным раком, чем у здоровых людей, и уменьшился после хирургического удаления (62). В образцах мочевого осадка от 125 больных раком предстательной железы и группы здоровых лиц чувствительность и специфичность ГПК-1 достигли 71 и 76% соответственно (63). Левин и др. также измерили GPC-1 в образцах плазмы и сыворотки и обнаружили, что он значительно повышен у пациентов с раком предстательной железы по сравнению с когортами здоровых людей (64).В совокупности эти сообщения позволяют предположить, что GPC-1 может быть полезным маркером для диагностики рака предстательной железы. Все эти исследования циркулирующего GPC-1 как клинического биомаркера рака были обобщены в таблице 1.

Таблица 1 . Циркулирующий GPC-1 как диагностический и прогностический маркер рака.

Тем не менее, некоторые исследования дали противоречивые результаты. В отчете Zhou et al. Был сделан вывод, что уровень GPC-1 в сыворотке является прогностическим фактором, но не идеальным маркером для клинического диагноза PDAC (68).Об аналогичном открытии сообщили Frampton Prado et al. (66). Лай и др. обнаружили, что уровень экзосомального GPC-1 в плазме не мог отличить пациентов с PDAC от контрольной группы, в то время как панель микроРНК в экзосомах вместо этого была превосходным биомаркером рака поджелудочной железы (65). Более того, Люсьен и соавт. измерили GPC-1 + EV в образцах крови и обнаружили, что они не могут эффективно отделить пациентов с раком поджелудочной железы от пациентов с доброкачественным заболеванием поджелудочной железы (67).

Есть множество причин, которые могут объяснить эти противоречивые результаты.Во-первых, GPC-1 не является тканеспецифическим белком. База данных атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/) и всесторонний анализ протеома тканей человека показывают, что GPC-1 широко экспрессируется в головном мозге, желудочно-кишечном тракте, мочевыделительной и репродуктивной системах (69). GPC-1, экспрессируемый из раковой ткани, вероятно, смешивается с этими нормальными выделениями из других тканей. Кроме того, во многих упомянутых выше исследованиях специфичность антитела GPC-1 серьезно не подтверждалась, что могло легко привести к ложным результатам (70).Многие из этих антител были созданы синтетическими короткими пептидами или белковыми фрагментами, экспрессированными в системах, отличных от млекопитающих, поэтому в них не было необходимых модификаций (особенно гликозилирования и HS-цепей на GPC-1) и настоящих структур. В идеале иммуногистохимическое окрашивание GPC-1 должно быть подтверждено вестерн-блоттингом с тем же антителом, чтобы показать, демонстрируют ли блоты какие-либо другие неспецифические полосы и хорошо ли коррелируют результаты этих двух методов. Кроме того, в нескольких исследованиях была тщательно изучена взаимосвязь между уровнями GPC-1 в сыворотке и размером раковой ткани, процентом клеток GPC-1 + и концентрацией GPC-1 в общем гомогенате раковой ткани.Кроме того, высвобождение GPC-1 зависит от протеазы Notum, которая не всегда может экспрессироваться в нормальном количестве и иметь нормальную активность в раковых тканях. Примечательно, что во многих исследованиях в качестве образца для измерения GPC-1 использовалась сыворотка. Сыворотка отличается от плазмы не только отсутствием фибриногена и других компонентов, но, что немаловажно, содержит огромное количество активных факторов свертывания крови, каждый из которых является высокоактивной протеазой. Неизвестно, может ли какой-либо из них расщеплять GPC-1, что приводит к ложным результатам.В некоторых исследованиях для анализа использовались электромобили определенных размеров из плазмы. Однако остается сомнительным, представляют ли эти EV все EV в экспрессии GPC-1 непредвзято. Кроме того, экстракция EV для измерений GPC-1 еще не оказалась ни необходимой, ни осуществимой в клинических лабораториях. Поэтому ожидается, что более тщательные и строгие исследования позволят установить, может ли GPC-1 в крови быть клиническим биомаркером некоторых видов рака.

Заключительные замечания

Glypicans и другие HSPG очень важны для модуляции передачи сигналов фактора роста.Они аномально экспрессируются в некоторых раковых тканях и причинно участвуют в онкогенезе. GPC-1 является новым членом глипикана, который, как было широко продемонстрировано, увеличивается при некоторых видах рака. Несмотря на несколько противоречивых результатов, биомаркерный потенциал GPC-1 заслуживает дальнейшего изучения. Поскольку мембранные и внеклеточные белки более терапевтически доступны и обладают большим потенциалом в качестве клинических биомаркеров, GPC-1 и другие HSPG будут продолжать интересовать область исследований для лучшего выяснения их механистической роли и диагностической ценности в клинических условиях.

Вклад авторов

Все перечисленные авторы внесли существенный, непосредственный и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее для публикации.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81601765 для SW), Нанкинским фондом развития медицинской науки и техники (QRX17142 для SW) и Научно-исследовательским центром Нанкинской больницы барабанной башни (RE445 для BB).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Ссылки

1. Ferlay J, Colombet M, Soerjomataram I, Mathers C, Parkin DM, Pineros M, et al. Оценка глобальной заболеваемости раком и смертности от рака в 2018 г.: источники и методы GLOBOCAN. Int J Рак . (2019) 144:1941–1953. doi: 10.1002/ijc.31937

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

2. Санчес-Вега Ф., Мина М., Армения Дж., Чатила В.К., Луна А., Ла К. и др. Онкогенные сигнальные пути в атласе генома рака. Сотовый . (2018) 173:321–37. дои: 10.1158/1538-7445.AM2018-3302

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

3. Bailey MH, Tokheim C, Porta-Pardo E, Sengupta S, Bertrand D, Weerasinghe A, et al. Всесторонняя характеристика генов-возбудителей рака и мутаций. Сотовый . (2018) 173:371–85. doi: 10.1016/j.cell.2018.02.060

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

8. Нагараджан А., Малви П., Ваджапей Н.Гепарансульфат и гепарансульфатные протеогликаны в инициации и прогрессировании рака. Передний эндокринол . (2018) 9:483. doi: 10.3389/fendo.2018.00483

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

9. Christianson HC, Svensson KJ, van Kuppevelt TH, Li JP, Belting M. Экзосомы раковых клеток зависят от протеогликанов гепарансульфата клеточной поверхности для их интернализации и функциональной активности. Proc Natl Acad Sci USA . (2013) 110:17380–5.doi: 10.1073/pnas.1304266110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

11. Белтинг М., Борсиг Л., Фустер М.М., Браун Дж.Р., Перссон Л., Франссон Л. и др. Ослабление опухоли за счет комбинированного истощения гепарансульфата и полиаминов. Proc Natl Acad Sci USA. (2002) 99:371–6. doi: 10.1073/pnas.012346499

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

16. Lu H, Niu F, Liu F, Gao J, Sun Y, Zhao X. Повышенная экспрессия глипикана-1 связана с неблагоприятным прогнозом при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. Рак Мед . (2017) 6:1181–91. doi: 10.1002/cam4.1064

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

18. Льюис Дж.М., Вьяс А.Д., Цю Ю., Мессер К.С., Уайт Р., Хеллер М.Дж. Комплексный анализ биомаркеров экзосомальных белков на электрокинетических чипах переменного тока позволяет быстро выявлять рак поджелудочной железы в крови пациентов. АКС Нано . (2018) 12:3311–20. doi: 10.1021/acsnano.7b08199

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

20.Алмонд А. Многомасштабное моделирование структуры и динамики гликозаминогликанов: современные методы и проблемы. Curr Opin Struc Biol . (2018) 50:58–64. doi: 10.1016/j.sbi.2017.11.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

22. Vicente CM, Da Silva DA, Sartorio PV, Silva TD, Saad SS, Nader HB, et al. Гепарансульфатные протеогликаны при колоректальном раке человека. Analyt Cell Pathol. (2018) 2018: 8389510–95. дои: 10.1155/2018/8389595

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

23.Чжан З., Куманс С., Дэвид Г. Передача сигналов FGF2-FGFR1, поддерживаемая мембранным гепарансульфатным протеогликаном: доказательства в поддержку модели «совместных концевых структур». J Биол Хим . (2001) 276:41921–9. doi: 10.1074/jbc.M106608200

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

25. Stadlmann S, Gueth U, Baumhoer D, Moch H, Terracciano L, Singer G. Экспрессия Glypican-3 в первичных и рецидивирующих карциномах яичников. Int J Gynecol Pathol. (2007) 26:341–4. дои: 10.1097/pgp.0b013e31802d692c

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

28. Bosse KR, Raman P, Zhu Z, Lane M, Martinez D, Heitzeneder S, et al. Идентификация GPC2 в качестве онкопротеина и потенциальной иммунотерапевтической мишени при нейробластоме высокого риска. Раковая ячейка . (2017) 32: 295–309. doi: 10.1016/j.ccell.2017.08.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

29. Ли Н, Фу Х, Хьюитт С.М., Димитров Д.С., Хо М.Терапевтическое нацеливание на глипикан-2 через химерные антигенные рецепторы на основе однодоменных антител и иммунотоксины при нейробластоме. Proc Natl Acad Sci USA . (2017) 114:E6623–31. doi: 10.1073/pnas.1706055114

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

30. Truong Q, Justiniano IO, Nocon AL, Soon JT, Wissmueller S, Campbell DH, et al. Глипикан-1 как биомаркер рака предстательной железы: выделение и характеристика. J Рак . (2016) 7:1002–9.doi: 10.7150/jca.14645

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

31. Веллеман С.Г., Сонг Ю. Развитие и рост большой грудной (грудной) мышцы птиц: функция синдекана-4 и глипикана-1 в пролиферации и дифференцировке взрослых миобластов. Фронт Физиол . (2017) 8:577. doi: 10.3389/fphys.2017.00577

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

32. Авад В., Логан Д.Т., Мани К. GPC1 (глипикан 1). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol . (2014) 7:461–3. дои: 10.4267/2042/53965

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

33. Ченг Ф., Рушер К., Франссон Л., Мани К. Нетоксичный бета-амилоид, образующийся в присутствии глипикана-1 или продуктов его дезаминирования, образующихся при расщеплении гепарансульфата. Гликобиология . (2013) 23:1510–9. doi: 10.1093/гликоб/cwt079

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

34. O’Callaghan P, Sandwall E, Li JP, Yu H, Ravid R, Guan ZZ, et al.Накоплению гепарансульфата с отложениями Абета при болезни Альцгеймера и мышах Tg2576 способствуют глиальные клетки. Патология головного мозга. (2008) 18:548–61. doi: 10.1111/j.1750-3639.2008.00152.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

35. Watanabe N, Araki W, Chui DH, Makifuchi T, Ihara Y, Tabira T. Glypican-1 как связывающий Abeta HSPG в мозге человека: его локализация в доменах DIG и возможная роль в патогенезе болезни Альцгеймера. FASEB J . (2004) 18:1013–5. doi: 10.1096/fj.03-1040fje

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

36. Cappai R, Cheng F, Ciccotosto GD, Needham BE, Masters CL, Multhaup G, et al. Белок-предшественник амилоида (АРР) болезни Альцгеймера и его паралог, APLP2, модулируют катализируемую Cu/Zn-оксидом азота деградацию глипикан-1 гепарансульфата in vivo . J Биол Хим . (2005) 280:13913–20. doi: 10.1074/jbc.M4000

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

37.Клефф Дж., Ишивата Т., Кумбасар А., Фрисс Х., Бюхлер М.В., Ландер А.Д. и др. Гепарансульфатный протеогликан глипикан-1 клеточной поверхности регулирует действие фактора роста в клетках карциномы поджелудочной железы и сверхэкспрессируется при раке поджелудочной железы человека. Дж Клин Инвест. (1998) 102:1662–73. дои: 10.1172/JCI4105

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

38. Kayed H, Kleeff J, Keleg S, Jiang X, Penzel R, Giese T, et al. Корреляция экспрессии глипикана-1 с рецепторами TGF-бета, BMP и активина при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. Интерн. Дж. Онкол . (2006) 29:1139–48. doi: 10.3892/ijo.29.5.1139

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

39. Duan L, Hu X, Feng D, Lei S, Hu G. GPC-1 может служить предиктором периневральной инвазии и прогностическим фактором выживания при раке поджелудочной железы. Азиатский J Surg . (2013) 36:7–12. doi: 10.1016/j.asjsur.2012.08.001

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

40. Davies EJ, Blackhall FH, Shanks JH, David G, McGown AT, Swindell R, et al.Распределение и клиническое значение протеогликанов гепарансульфата при раке яичников. Clin Cancer Res . (2004) 10:5178–86. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-03-0103

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

41. Суховских А.В., Мостович Л.А., Кунин И.С., Бобоев М.М., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., и соавт. Экспрессия протеогликанов в нормальной ткани предстательной железы человека и раке предстательной железы. ISRN Oncol. (2013) 2013:1–9. дои: 10.1155/2013/680136

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

42.Хара Х., Такахаши Т., Серада С., Фуджимото М., Окавара Т., Накацука Р. и др. Сверхэкспрессия глипикана-1 указывает на плохой прогноз и его химиорезистентность при плоскоклеточной карциноме пищевода. Брит Джей Рак. (2016) 115:66–75. doi: 10.1038/bjc.2016.183

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

43. Фернандес-Вега И., Гарсия-Суарес О., Гарсия Б., Креспо А., Астудильо А., Кирос Л.М. Протеогликаны гепарансульфата подвергаются дифференциальным изменениям экспрессии при правостороннем колоректальном раке в зависимости от их метастатического характера. Рак BMC. (2015) 15:742. doi: 10.1186/s12885-015-1724-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

44. Де Робертис М., Аригон М., Лойаконо Л., Риккардо Ф., Калоджеро Р.А., Федорова Ю. и соавт. Новое понимание регуляции Notum и glypicans при колоректальном раке. Онкотаргет . (2015) 6:41237–57. doi: 10.18632/oncotarget.5652

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

45. Li J, Li B, Ren C, Chen Y, Guo X, Zhou L, et al.Клиническое значение циркулирующих GPC1-позитивных экзосом и его регуляторных миРНК у пациентов с раком толстой кишки. Онкотаргет . (2017) 8:101189. doi: 10.18632/oncotarget.20516

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

46. Танака М., Исикава С., Ушику Т., Морикава Т., Исагава Т., Ямагиши М. и соавт. EVI1 модулирует онкогенную роль GPC1 в канцерогенезе поджелудочной железы. Онкотаргет . (2017) 8:99552. doi: 10.18632/oncotarget.20601

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

47.Мацуо И., Кимура-Йошида С. Внеклеточная модуляция передачи сигналов фактора роста фибробластов через гепарансульфатные протеогликаны в развитии млекопитающих. Curr Opin Genet Dev . (2013) 23:399–407. doi: 10.1016/j.gde.2013.02.004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

51. Цяо Д., Мейер К., Мундхенке С., Дрю С.А., Фридл А. Протеогликаны сульфата гепарана как регуляторы передачи сигналов фактора роста-2 фибробластов в эндотелиальных клетках головного мозга. J Биол Хим .(2003) 278:16045–53. дои: 10.1074/jbc.M211259200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

52. Chamorro-Jorganes A, Araldi E, Rotllan N, Cirera-Salinas D, Suarez Y. Саморегуляция глипикана-1 с помощью интронной микроРНК-149 точно настраивает ангиогенный ответ на FGF2 в эндотелиальных клетках человека. J Cell Sci. (2014) 127:1169–78. doi: 10.1242/jcs.130518

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

55. Уиппл К.А., Янг А.Л., Корк М.Генетическая мышиная модель рака поджелудочной железы, управляемая KrasG12D, требует glypican-1 для эффективной пролиферации и ангиогенеза. Онкоген. (2012) 31:2535–44. doi: 10.1038/onc.2011.430

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

56. Aikawa T, Whipple CA, Lopez ME, Gunn J, Young A, Lander AD, et al. Глипикан-1 модулирует ангиогенный и метастатический потенциал раковых клеток человека и мыши. Дж Клин Инвест. (2008) 118:89–99. дои: 10.1172/JCI32412

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

58.Li J, Kleeff J, Kayed H, Felix K, Penzel R, Büchler MW, et al. Антисмысловая трансфекция глипикана-1 модулирует TGF-β-зависимую передачу сигналов в клетках рака поджелудочной железы Colo-357. Биохим Биоф Рез Ко . (2004) 320:1148–55. doi: 10.1016/j.bbrc.2004.06.063

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

59. Melo SA, Luecke LB, Kahlert C, Fernandez AF, Gammon ST, Kaye J, et al. Glypican-1 идентифицирует экзосомы рака и обнаруживает ранний рак поджелудочной железы. Природа .(2015) 523:177–82. doi: 10.1038/nature14581

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

60. Цянь Ю.Ю., Тан Ю.Л., Чжан Ю., Ян Ю.Ф., Ли XQ. Прогностическое значение глипикана-1 для пациентов с распространенным раком поджелудочной железы после регионарной внутриартериальной химиотерапии. Онкол Летт . (2018) 16:1253–8. doi: 10.3892/ol.2018.8701

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

61. Ян К.С., Им Х., Хонг С., Перголини И., Дель Кастильо А.Ф., Ван Р. и соавт.Многопараметрическое профилирование EV в плазме облегчает диагностику злокачественных новообразований поджелудочной железы. Sci Transl Med. (2017) 9:13226. doi: 10.1126/scitranslmed.aal3226

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

62. Li J, Chen Y, Guo X, Zhou L, Jia Z, Peng Z, et al. Экзосома GPC1 и ее регуляторные микроРНК являются специфическими маркерами для обнаружения и таргетной терапии колоректального рака. Дж Селл Мол Мед . (2017) 21:838–47. doi: 10.1111/jcmm.12941

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

63.Кэмпбелл Д.Х., Лунд М.Е., Нокон А.Л., Коцци П.Дж., Фриденберг М., Де Соуза П. и др. Обнаружение экспрессии глипикана-1 (GPC-1) в отложениях клеток мочи при раке предстательной железы. ПЛОС ОДИН . (2018) 13:e196017. doi: 10.1371/journal.pone.0196017

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

64. Левин Р.А., Лунд М.Е., Труонг К., Ву А., Шор Н.Д., Зальцштейн Д.Р., и соавт. Разработка надежного анализа для измерения глипикана-1 в плазме и сыворотке показывает, что циркулирующий глипикан-1 является новым биомаркером рака предстательной железы. Онкотаргет . (2018) 9:22359. doi: 10.18632/oncotarget.25009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

65. Lai X, Wang M, McElyea SD, Sherman S, House M, Korc M. Сигнатура микроРНК в циркулирующих экзосомах превосходит уровни экзосомального глипикана-1 для диагностики рака поджелудочной железы. Рак Летт . (2017) 393:86–93. doi: 10.1016/j.canlet.2017.02.019

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

66.Фрэмптон А.Э., Прадо М.М., Лопес-Хименес Э., Фахардо-Пуэрта А.Б., Джавад З., Лоутон П. и др. Глипикан-1 обогащен циркулирующими экзосомами при раке поджелудочной железы и коррелирует с опухолевой массой. Онкотаргет . (2018) 9:19006–13. doi: 10.18632/oncotarget.24873

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

67. Люсьен Ф., Лак В., Билладо Д.Д., Боргида А., Галлинджер С., Леонг Х.С. Глипикан-1 и гликопротеин-2, несущие внеклеточные везикулы, не позволяют отличить рак поджелудочной железы от доброкачественных заболеваний поджелудочной железы. Онкотаргет . (2019) 10:1045. doi: 10.18632/oncotarget.26620

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

68. Zhou CY, Dong YP, Sun X, Sui X, Zhu H, Zhao YQ, et al. Высокий уровень глипикана-1 в сыворотке указывает на неблагоприятный прогноз при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. Рак Мед. (2018) 7:5525–33. дои: 10.1002/cam4.1833

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Путь понимания — Развитие лекционариев и их использование в лютеранской церкви

Путь понимания — Развитие лекционеров и их использование в лютеранской церкви
Развитие лекций и их использование в Лютеранская церковь

Представлено Евангелическо-лютеранскому Синоду Генеральный пастор Конференция

Блумингтон, Миннесота

68 января 1998 г.

Авторские права принадлежат Rev.Александр Кольцо

Паркленд Ев. Лютеранская церковь Такома, Вашингтон,

Чуть больше года назад один из братьев написал Корену десять причин отказаться от проповеди лекционария. Зная пастора, который сделал сообщение и оценивая его ироничные комментарии, поскольку я прочитал причины, по которым я благодарил Бога, что я был причислен к людям с таким умом и образованием что один из них мог создать такую ​​искусную пародию на реформатскую ментальность. Он писал, что, оставив лекционарий, среди прочего, вы получите свобода поощрять мирское чтение Библии, формировать и формировать видение для вашей церкви, чтобы создавать, а не подчиняться, и позволять проповедникам делиться чему их учит Бог. Звучит прямо как что-то из RIM , Я подумал про себя. Хотел бы я быть таким умным. Через два дня старший пастор в Паркленде оставил на моем столе экземпляр журнала «Нововведения поклонения» , открылась тематическая статья этого номера: «Лекционарный плен Церковь: десять причин отказаться от лекционарной «привычки». моей первой реакцией было облегчение, так как мое эго было успокоено тем, что десять причины были сфальсифицированы, а я все еще был таким же умным, как я всегда думал сам.Затем мой коллега поплатился за свою глупость, натравив меня на любимую коньком, и всю следующую неделю мне придется слушать мое изложение о пороки отказа от лекционария и церковного года.

Я не собираюсь читать вам ту же самую проповедь, так как случайный опрос духовенства среди нашего братства, вероятно, показал бы, что подавляющее большинство, если не все, в своей проповеди следуют лекционарному циклу. Несмотря на процитированное выше название статьи, мы понимаем, что лекционарий это не окованный железом ограничительный плен, который некоторые пытаются изобразить.Даже такой экстремист, как я, понимает, что события происходят в жизни собрания, такие как миссионерские фестивали, воскресенье христианского образования и годовщины, заставляющие отойти от перикопальных чтений. Верно, такие случайные отъезды в лучших традициях лекционария проповеди, поскольку лекционарий никогда не предназначался для форсированного марша, а путь, по которому каждый год Церковь будет проходить через ее праздники и посещать главные учения Веры. Случайные поездки только усиливают поездка.

Таким образом, как и большинство обычаев и традиций лютеранской церкви, использование лекционария в качестве основы и руководства для наших проповеднических нужд никаких извинений. Скорее, это обычай, уходящий своими корнями в самые ранние времена. традициях церкви и зарекомендовала себя на протяжении веков. это его случайное забвение реформаторами и, к сожалению, некоторыми лютеранами, что требует объяснения.

 

История лекционария

христианских общины первого века взяли пример с богослужения из практики поклонения синагоги, которая использовала лекционарий для определения показаний для службы.Это чтение Писания называлась микра , что первоначально означало «созыв вместе». но стали относиться главным образом к чтению, а иногда и преподаванию Писания. Хотя на практике были некоторые различия, обычно было два Писания. чтения в каждой службе. Первый был из Торы, разделенный на 150 части для чтения lectio continua в трехлетнем цикле, затем второй урок от Пророков2. Некоторые синагоги, возможно, также использовали трехлетний цикл для чтения псалмов.Уроки прочитаны, они будет проповедоваться раввином. Возможно, лучший пример, который у нас есть взято из Св. Луки 4: 1621, рассказа о проповеди Иисуса в синагоге. в Назарете. Ему вручают свиток Исаии, и Он разворачивает его перед читает пророков на день, читает лекцию, а затем проповедует в теме.

Что эта практика была перенесена в богослужение христиан Церковь видна из упоминаний о ней, например, в 1 Тимофею 4:13, « hews erchomai proseche tei anagnwsei, tei paraklesei, tei дидаскалия. ». Использование Св. Павлом anagnwsis очень описательно, поскольку это слово постоянно используется в Септуагинте для перевода arqm. Таким образом, первую часть отрывка можно было бы перевести так: «Пока Я приду, обратите внимание на избранное чтение дня». в 50-х и 60-х годах христианские общины стали дополнять чтения из Ветхого Завета с чтениями из писаний апостолов. В таких отрывках, как 1 Фессалоникийцам 5:27 и Колоссянам 4:16, Павел под по вдохновению Святого Духа и, по-видимому, осознавая это, говорит этим церквях, что его письма должны быть прочитаны на службе (опять же с использованием anagnwsis , так что, возможно, «были показания»), затем разошлись по другим соседним общины, чтобы они тоже могли их использовать.Как были написаны Евангелия и распространялись, они также читались на общественном богослужении. Как и следовало ожидать, практика чтения Писания была довольно последовательной. Юстин Мученик (ум. 166) писал в своей «Апологии»: «В день, именуемый воскресеньем, все живущие в города или в деревне собираются вместе в одном месте, и воспоминания Апостолы или писания пророков читаются, пока позволяет время; затем, когда чтец прекратил, председатель [председательствующий министр] устно наставляет и увещевает подражать этим благам.»3

В то время как основная практика чтения Писания и проповеди по нему была общее, что было прочитано, а сколько нет. В некоторых местах было сплошное чтение с воскресенья до воскресенья, пока книга не будет закончена. Некоторые районы Испании а Франция использовала уроки, составленные из мозаики Писания, собирая воедино короткие отрывки из различных частей Писания.4 Некоторые церкви использовали гармонии Евангелий и читать из них. И пока кое-где читаю два урока каждое воскресенье другие читают целых четыре.Всего lectio continua , непрерывное чтение книги с воскресенья на воскресенье, по-видимому, сложившаяся практика в той или иной форме.

Однако по мере развития церковного года практика lectio continua уменьшился. Уже в первом веке Церковь праздновала Пасху, которая вскоре стало празднованием Пасхи и Пятидесятницы, которое вскоре стало празднования Великого поста, Пасхи, Пятидесятницы и Богоявления, которые вскоре получить идею.К четвертому веку праздник составляет половину церковного года. в том виде, в каком мы его знаем (Адвент Пятидесятницы) был общеустановленным, завершенным с днями, отведенными для памяти святых и мучеников. Эти фестивали а поминки требовали собственного чтения и, таким образом, прерывали lectio continua . По мере того, как «перерывов» стало меньше, исключением и скорее правилом, lectio continua уступили место предписанным чтения. Чтобы пастырь знал, какое чтение предписано, у епископов были подготовлены указатели, которые давали не только ссылки, но и показывали первое и последнее слово каждого урока.Назначенная часть Писания был известен как h´ perikophv, перикопа5, так как он был частью Писание «вырезано» из Писаний на тот день. Так как иногда использовались другие книги, помимо Библии (например, жития святых, мартирологи, проповеди или сочинения известных проповедников и т. д.), многие епископы и отцы церкви тоже выпустили книги под названием приходит, своего рода перикопа и книга помощи проповеди все в одном. Эти книги включали не только чтения на каждый день, но часто и с комментариями.Какой-то приходит , комментарий и все, возможно, даже были подготовлены так, чтобы их можно было читать во время службу, функционирующую как доникейская церковная почтальон.

Вскоре были подготовлены книги с уроками на самом деле выписаны, избавляя от необходимости искать их в другом месте; послания выписанные в эпистолярии , евангелия в евангелариуме . Книга с полным набором уроков называлась лекционариумом .6 Большинство из них были неполными по сегодняшним меркам в том смысле, что обычно назначал реквизиты только на фестивальную половину года с подборкой необязательных чтений и свойств на оставшуюся часть года, которые будут использоваться в усмотрение пастыря.То же самое было и в период Богоявления, поскольку только в четвертом веке Рождество и Крещение стали отдельные фестивали.

 

Исторический лекционарий

То, что мы знаем сегодня как Исторический лекционарий, приходит к нам из Приходит Иероним (Джером). Дата и авторство этого документа оспариваются, однако самое позднее оно было написано кем-то в 471 году. прикрепленное к нему имя Иеронима сделало этот документ влиятельным сам по себе, но когда он был включен в Леонинское сакраментарий8, он стал стандартом. текст для Западной церкви.Даже тогда он предоставлял только заданные показания на Адвент, Рождество, Великий пост и Пасху. Остальная часть года все еще была покрыта по необязательным свойствам, включенным в , получается , или по прихоти местный епископ или пастор.

Триста лет спустя Карл Великий решил стандартизировать литургические практики в своих владениях, и в рамках этого его религиозный советник Алкуин9 сделать доработку Comes Hieronymi . То, что Алкуин в основном сделал, было возьмите григорианский сакраментарий, текущий стандарт в Риме, и введите это к империи Карла Манжа.Это был монументальный шаг в истории церкви, поскольку это стандартизировало поклонение в Западной церкви и поставило всех на запад Карпат буквально на той же странице, по крайней мере, для фестиваля часть года. И поскольку он стремился сократить службу, Алкуин внес два основных изменения в лекцион. Во-первых, он ликвидировал чтение урока Ветхого Завета. Во-вторых, он сократил многие послание и евангельские чтения. Где раньше урок мог быть таким длинным в виде двух или трех глав, теперь это обычно было одно повествование из евангелия. или раздел из послания, посвященный определенной теме.Существовал вероятно, ряд причин для обоих этих изменений, но что, вероятно, главным из них было снижение грамотности как народа, так и духовенства, нашествиями варваров.

Следующее серьезное изменение в лекционарии не произойдет до 13 числа. века и установление последнего общепринятого крупного праздника Церкви: Троица. Вскоре этот фестиваль стал доминировать во втором половине церковного года, а вместе с этим и установление назначенных свойства на весь год.Само по себе это не было ново; в некоторых местах было фактически установили круглогодичную собственность еще в 4 веке. Но Средневековье видело усиление как монархий, так и папства, оба из которых хотели иметь единую практику. Эпоха cuius regio eius lectio закончилась, и с всеобщим принятием Сарумского Миссала в конце 13 века литургическая практика Западной церкви, круглый год управлялся Историческим лекционарием.10

Эта практика была так хорошо построена и установлена, что даже во время переворот Реформации он остался нетронутым.Реформация никогда действительно задавался вопросом «Следует ли менять лекционарий?» только нужно ли его использовать. Как и следовало ожидать, такие люди, как Цвингли и Мюнцер отменил использование лекционариев вместе с наблюдением церковного года. Кальвин занял несколько более сдержанную позицию, отменив как церковный год, так и лекционарий, но заменяющий lectio continua , поскольку он видел гомилетическую ценность в том, чтобы иметь какое-то предписанное чтение. Лютеране, верные своей форме, хотели только отменить или реформировать эти вещи. которые затемняли Христа или продвигали лжеучения.лекционарий не подпадают ни под одну из этих категорий, и, таким образом, были сохранены лишь с небольшим пересмотр лютеранами: они добавили свойства для Троицы 25 и 26, эсхатологические уроки, призванные связать конец жизни с концом всего сущего. Они также перенесено празднование Преображения Господня с установленной даты с 6 августа до последнего воскресенья после Богоявления, подходящей кульминации сезона который празднует проявление славы и божественности Христа.

Это не значит, что лютеране не критиковали.В В письме своему другу Николасу Хаусманну в Цвикау Лютер описал богослужения в Виттенберге и прокомментировал чтения:

После [сбора] читается Послание. Конечно, время еще не все же попытаюсь пересмотреть здесь, так как ничего неевангелического не читается, кроме что те части Посланий Павла, в которых проповедуется вера, редко читают, а увещевания о нравственности чаще всего читать. Послания, кажется, были выбраны на редкость неученым и суеверный сторонник трудов.Но для обслуживания тех разделов в той вере во Христа, которой учат, следовало бы отдать предпочтение. То последние, безусловно, чаще упоминались в Евангелиях кем бы то ни было. был тем, кто выбрал эти уроки. Тем временем проповедь на народном языке придется восполнить недостающее.» 11

Какими бы критическими ни казались комментарии Лютера, их следует воспринимать с осторожностью. крупинка соль. Учитывая времена, когда он, возможно, был слишком чувствителен ко всему что, казалось, отвлекает от Sola Gratia. Действительно, в итоге мы видим что даже Лютер относился к себе с недоверием, так как, несмотря на его комментарии Сам Лютер предписывал использовать Исторический лекционарий как в Formula Missae и Deutsche Messe ,12 и все лютеранские алтари книги продолжали использовать его. Даже Аугсбургское исповедание и Извинения свидетельствуют о его официальном использовании в лютеранских общинах, когда в речи о традиции и Церкви лютеране заявили: «Многие традиции соблюдаются с нашей стороны, ибо они ведут к порядку в Церкви, как, например, порядок уроков в мессе [i.э., лекционарий] и главные праздники». «Мы сохраняем традиционные литургические формы, такие как порядок уроков, молитвы, облачения и т. д.»14 Следующие 400 лет лютеранского литургического жизнь (и римо-католиков, и англикан) управлялась Исторический лекционарий. Он послужил основой для наших постилей и преданий. книги, наши песнопения и церковная музыка, и даже до середины 20 века был индексом для каждого лютеранского сборника гимнов.

Конечно, были подготовлены и другие лекционеры.В 1896 году церкви г. Прусский союз, известный как Эйзенахская конференция, произвел лекционарий, популяризированный в Соединенных Штатах доктором Р.Ч.Х. Ленски и его заметками о сериал. Синодальная конференция подготовила серию, которая была принята в 1912 г. Скандинавские лютеранские церкви выпустили трехлетний лекционарий в 1868 г.15 Однако часто они выпускались не для того, чтобы заменить Исторический лекционарий. но дополнять его, обычно в качестве альтернативных текстов для проповеди16. и темы Исторического лекционария были сохранены.

Преимущества и недостатки

Тот факт, что исторический лекционарий использовался более шестисот лет это большая его заслуга. Это означает, что есть много ресурсов для него, в том числе многие написанные лютеранскими отцами. Лютеровская церковь и Дома Постилс, а также проповеди Бугенхагена, Герхарда и Вальтера все следуют Историческому лекционарию. Религиозные книги, такие как книга епископа «Семейные религиозные обряды» Лааша и Лютера последовали за «Историческим лекционарием» с намерение, чтобы поклонение в доме было эхом того, что было услышано в церкви в то воскресенье, и чтобы те удерживались от общественного богослужения (и в 18-го и 19-го века, когда эти книги были напечатаны, это было бы для большей частью означали поселенцев в Новом Свете) имел бы еще один связь со Святой Христианской Церковью.17 Большая часть нашего гимна была написана под влиянием Историческим лекционарием, поэтому ряд лютеранских адвентистских гимнов упомянуть о триумфальном въезде18. Этот эффект усугублялся тем, что Бах использовал его свойства в сочинении своих церковных кантат. Шестьсот лет также означает, что было время, чтобы исправить большинство ошибок. в отличие другие лекционарные серии (кроме тех, которые основаны на серии Historic), атрибуты дня всегда совпадают с показаниями, усиливая тему в течение дня, и уроки в течение каждого сезона объединяются, чтобы создать сезонная тема.Действительно, из всех лекционариев Исторический самый хорошо организованный; есть даже метод в кажущемся безумии Троицы сезоне.19 Что, возможно, является самым большим преимуществом сегодня, так это тот факт, что он лекционарий на один год. Если repetitio mater studiorum есть , то здесь здесь вы найдете больше всего повторений . Это особенно преимущество в нашу эпоху снижения библейской грамотности.

В то же время, поскольку это серия на один год, она использует ограниченный количество текстов.Исторический лекционарий вырос во времена, когда он был обычным явлением. проводить службы в такие дни, как Пасхальный понедельник, что также может объяснить, почему некоторые уроки теперь опущены20. Возможно, самым ярким из них является притча о блудном сыне.

 

Межлютеранская комиссия по поклонению (ILCW)

В 1956 году, всего через пятнадцать лет после выпуска Лютеранский сборник гимнов, Лютеранские церковные органы в Соединенных Штатах добивались пересмотра этой книги.В 1965 году Синод Лютеранской церкви-Миссури постановил назначить комиссия, которая будет работать с другими лютеранскими церковными органами для производства новый общий сборник гимнов, современный наследник Лютеранского сборника гимнов . С этой целью 10 февраля 1966 г. представители Лютеранской церкви штата Миссури Синод, Американская лютеранская церковь и Лютеранская церковь в Америке встретились в Чикаго и сформировал то, что впоследствии стало Межлютеранской комиссией по Богослужения (ILCW)21. Позднее к нему присоединились представители Словацкого Синода. и Евангелическо-лютеранская церковь Канады (ELCIC).22 Преследуя выпуск нового сборника гимнов, ILCW выпустил ряд ресурсов для поклонения для пробы и использования в собраниях. Они были распространены через издание из серии под названием Современное поклонение . Современное поклонение 6 , выпущенный в 1973 году, касался церковного года и календаря и вводил два новых лектора. В этом томе комиссия написала:

«В последние годы широко распространено беспокойство с назначенные чтения, большое количество экспериментов и желание либо реформа перикопов, либо совершенно новый лекционарий.Это беспокойство не просто продукт перемен в обществе и церкви; он глубже корни. Он отражает различные влияния современной теологии, социально-этической участие, развитие практики поклонения и особенно влиятельные движение библейского богословия последних десятилетий». 23

При обсуждении пересмотра были некоторые дебаты относительно достоинств идет многолетняя серия «О том, верны ли мы нашему наследию, соответствие мировому лютеранству в целом и благоговение перед западным лекционарная традиция должна преобладать, или соглашение с нашей сестрой церкви в Америке требовали трехлетней серии.24 Последнее касается победил. Одним из результатов II Ватиканского собора стала публикация Ordo Lectionum Missae в 1969 году, новая трехлетняя серия, которая вытеснил Историческую серию в Римско-католической церкви. Следующий год протестантская епископальная церковь, пресвитерианская церковь и объединенная церковь Христос принял Ордо в качестве основы для новых лекционариев в их церкви. Таким образом, в сентябре 1970 года ILCW просто последовала его примеру, выразив предпочтение трехлетней серии.В 1971 году ILCW опубликовал пересмотренный годичной серии, а через два года опубликовали свой magnum opus , новая трехлетняя серия, созданная по образцу римского Ordo . ILCW трехлетняя серия несколько вернулась к практике lectio continua с основным принципом присвоения синоптического евангелия каждому году. «Год А» посвящен Евангелию от Матфея, «Год Б» — Евангелию. Марка и «Год С» Евангелия от Луки. Евангелие от Иоанна используется во всех трех воскресеньях после Пасхи, а также служит для дополнить св.Отметить в классе B. Пытаясь вновь ввести чтение Ветхого Завета, Первый Урок, обычно выбираемый из Ветхого Завета, был назначен на каждое воскресенье, которое должно было согласовываться с чтением Евангелия. Исключением являются воскресенья после Пасхи, когда выбор выбран из Деяний. Послания также были назначены на каждый год для чтения lectio continua , поэтому не было предпринято никаких особых усилий для согласования Послания. с выбором Евангелия.

При выборе кандидатов комитет задал себе ряд вопросов.Главными из них были:

  1. Можно ли осмысленно толковать этот отрывок сегодня, можно ли проповедовать уместно в теме?
  2. Отражают ли чтения в целом весь совет Божий?
  3. Является ли чтение экзегетически оправданным? Есть ли текстовые проблемы в еврейском или греческом, которые делают значение отрывка неопределенным?
  4. Является ли чтение экуменическим? Насколько широко он используется для выражения прошлого использования и текущая практика?25

Комитет также заявил о «чувствительности к опасностям в некоторых тексты (т.г., непонимание в плане антисемитизма, если не внимательно объяснил).26

Эта серия быстро стала популярной в лютеранских кругах, о чем свидетельствует тот факт, что в течение пятнадцати лет после его выпуска лютеранские издательства больше не выпускали материалы для поклонения на основе Исторического лекционария. Как и в большинстве распространенных ресурсов, в настоящее время существует несколько версий Лекционарий ILCW в печати. Он был несколько адаптирован ЖХ-МС для публикации. в Lutheran Worship , а также Синодом Висконсина (WELS) для публикации в Христианское поклонение . Евангелическо-лютеранский гимн использует по сути, та же версия, что и в Lutheran Worship . По большей части различия в различных версиях незначительны, часто сосредоточив внимание на продолжительности чтения (например, следует ли нам читать все Св. Иоанна 9, или просто избранные стихи?).

Преимущества и недостатки

После публикации лекционария в 1973 году сам ILCW указал то, что часто называют его самым большим преимуществом: больший выбор текстов, таким образом подвергая собрание более широкому кругу Священного Писания.Многие пастыри приветствовал возможность проповедовать на новую разновидность текстов. Генерал практика lectio continua , используемая в серии, может дать собранию шанс почувствовать вкус книги, что может быть особенно полезно в евангелия. И с популярным признанием сериала теперь ряд подсказок для проповедей и основанных на них материалов для поклонения.

Самыми большими недостатками ILCW являются его происхождение и длина. То серия была создана межлютеранской группой, которая теологически либеральна, и его богословие часто проявляется в их выборе для чтения.В целом, ILCW опустил чтения, прямо говорящие о божественности Иисуса (Св. Иоанна 8:4659 нет в ILCW), о чудесах, совершенных апостолами, и часто допускает пропуск чтений, осуждающих такие грехи, как прелюбодеяние и гомосексуальность. Самым вопиющим упущением является отсутствие тексты, в которых речь идет о суде над грешниками. Традиционно эти чтения использовались во второе-последнее воскресенье церковного года, но теперь они либо опущены, либо перечислены как необязательные. Единственным исключением является притча о овец и коз, но это, вероятно, было сохранено, потому что оно сохраняет возможность морализаторства.

Честно говоря, я также изучил лекционарий ILCW, найденный в Евангелических Лютеранский гимн , где большая часть необязательных, «оскорбительных» материал был восстановлен как часть чтений, и где суждение дневные показания указаны для второго-последнего воскресенья. Если вы получаете бюллетени и материалы поклонения из Concordia или Northwestern, вы используете версию ILCW похожа на эту.27 Однако эти подчищенные версии по существу сделайте необязательные чтения первичными, они почти никогда не восстанавливают упущения.

И так же, как краткость Исторического лекционария и хороша, и плоха, такова же длина трехлетнего ряда ILCW. Притчи и рассказы, которые слушались бы каждый год, теперь заслушиваются раз в три года, а если следовать циклу проповеди, проповедуют только раз в девять годы. Кроме того, за исключением большинства воскресений во время фестивальной части церковного года тематический подход к воскресеньям утрачен. Должно Также следует отметить, что аргумент «чем больше Библии, тем лучше» не лишен своих заблуждений.На первый взгляд это кажется хорошим, даже благочестивым идея. Но мотивом этого было более критическое понимание Писания: что в Библии содержится слово Божие, и функция лекционарий должен следить за тем, чтобы классические тексты передавались следующему поколению.28 Это большой отход от учения Лютера о Священном Писании. поскольку было Christum treibt (что приносит нам Христа), а также почему тенденция использования Ветхого Завета в этих лекционариях заключается в том, чтобы увидеть это как независимая лекция от «Еврейских Писаний», скорее чем как типологический комментарий к евангельскому чтению.

 

Пересмотренный общий лекционарий

Какой бы популярной ни была трехлетняя серия ILCW, она может стать одной из самых самая недолговечная лекционная серия. Через два года после образования ILCW, представители ELCA, ELCIC и LC-MS присоединились к экуменической группа под названием «Консультации по общим текстам» (CCT). Состоит из библейских, лингвисты и литургики из различных христианских конфессий, их цель – подготовить тексты и материалы для богослужения для использования на Севере. Америки, в том числе лекционеров.В 1978 году они спонсировали встречу в Вашингтоне. DC, целью которого было сформировать комитет, который урегулировал бы разногласия между различными конфессиональными использованиями трехлетнего ряда. В 1983 году они опубликовали Общий лекционарий .

Самым большим изменением, которое они привнесли в трехлетнюю серию, стал пересмотр Уроков Ветхого Завета. Предыдущие лекционеры придерживались типологического подход к чтениям из Ветхого Завета, подбор текстов со ссылкой к их новозаветному исполнению.CCT «поднял серьезные вопросы о «типологическом» использовании римскими лекционариями книг еврейского Писания»29 и, таким образом, для Common Lectionary предложил образец полунепрерывных чтений, по существу независимый от Евангелия Урок. В год А двадцать воскресений были посвящены чтению Пятикнижия, затем три воскресенья Руфи. В классе B четырнадцать воскресений были посвящены к жизни Давида и четырем воскресеньям литературы мудрости. Год C имеет десять Воскресенья посвящены Илии и Елисею, а пятнадцать воскресений посвящены главным пророкам.Согласно CCT, «уроки по-прежнему типологически контролируются. Евангелием, но в более широком смысле, чем воскресенье за ​​воскресеньем, чтобы сделать возможно полунепрерывное чтение некоторых важных повествований Ветхого Завета»30. Полунепрерывные чтения не использовались на крупных фестивалях или в течение сезонов. таких как Адвент или Пасха, и во время других частей фестиваля половина году была предпринята некоторая попытка использовать непрерывные показания, которые улучшили тема сезона. ОДТ также включало чтение псалма в лекций и принял практику Епископальной церкви замены «Воскресенья после Пятидесятницы» с ключом «Propers» к гражданский календарь (т.г., вместо «Девятое воскресенье по Пятидесятнице» теперь у вас есть «Правильный 11, который будет использоваться в воскресенье между 17 июля и 23 включительно»).

Общий лекционарий был впервые использован на пробной основе рядом лютеранских и епископальных конгрегаций и был официально принят Англиканская церковь Канады в 1985 году. Однако она также подверглась ряду критических замечаний: направлено особенно из лютеранских, епископальных и римско-католических источников. Они отметили:

  1. Между Римско-католические, епископальные и лютеранские лекционеры, которых необходимо было примирить,
  2. Следует приложить дополнительные усилия для укрепления отношений между Ветхозаветные и евангельские чтения,
  3. Эта неразбериха вызывается в собрании использованием трех несвязанные чтения и
  4. Использование псалма и трех длинных чтений в одной службе это слишком много для обычного собрания.31

В ответ на эту критику CCT провел пересмотр Common Lectionary , а в 1992 году опубликовал Revised Common Lectionary . Критика отрывков из Ветхого Завета была рассмотрена постановкой из трех версий RCL. Существует римско-католическая версия, которая в раз использует чтения из апокрифов для урока Ветхого Завета. Там две протестантские версии, одна из которых содержит ветхозаветный урок. соответствует евангельскому уроку, а один — полунепрерывному ветхозаветному чтения.К этому добавилось больше историй о верующих женщинах. ОДТ также воспользовался возможностью для дальнейшей оценки и устранения текстов, которые, «когда вырванные из своего культурного и религиозного контекста Древнего Ближнего Востока, может быть неправильно понято общинами конца двадцатого века»32. Другими словами, они убрали то, что могло показаться антисемитским.

На момент написания этой статьи RCL был официально одобрен для использования и по существу принята Епископальной церковью, ELCA и ELCIC. это официальный лекционарий Объединенной методистской церкви, пресвитериан, Объединенной церкви Христа и учеников Христа.Из-за его повсеместного принятия ELCA, RCL, в настоящее время является наиболее широко используемым лекционером в американском лютеранском языке. церкви (Просто посмотрите, какое чтение указано первым в вашем календаре AAL).

Преимущества и недостатки

Преимущества RCL такие же, как и у ILCW, с упомянутым редакцией дополнением истинно вселенского лекционарий. Недостатки тоже схожи, однако с RCL они являются более выраженными.На его подготовку сильно повлияла высшая критика. и либеральная теология. Там, где ILCW, как правило, пропускает или редактирует, плоский RCL вне делает это. Не используются разделы, которые могут показаться антисемитскими, такие как Св. Иоанна 11:4553 или побивание Стефана камнями. Разделы, которые выступают против гомосексуальность явно опущены, как и стихи, предупреждающие о лжепророков.33 Таким серьезным изъяном является RCL как с точки зрения герменевтики, и литургической точки зрения, что было бы трудно санкционировать его использование в лютеранской общине.Комиссия LC-MS по поклонению рассмотрела сериал и рекомендует не использовать его в своих собраниях. То Синод Висконсина не делал заявлений за или против RCL, и хотя они рекомендуют версию ILCW, найденную в Christian Worship , Издательский дом Northwestern в настоящее время рассматривает возможность сделать RCL доступным. в бюллетенях и вкладышах к бюллетеням, особенно для их учетных записей, не входящих в WELS. И хотя на момент написания этой статьи ни Concordia, ни Northwestern Publishing В планах Хауса официально перейти на него, его использование набирает обороты.Если ваша церковь в настоящее время использует лекционарий ILCW, возможно, стоит периодически проверять показания и проверять, соответствуют ли они тому, что напечатано на страницах 199201 в ELH . Если они не совпадают, может быть, издательство для удобства (и, очень вероятно, из коммерческих соображений) перешел на RCL.

 

Заключение

Вероятность найти идеального лекционария так же высока, как и идеальный перевод Библии.Подобно переводам, можно сказать о лекционариях. что одни лучше других, что неизбежно приходится иметь дело с факторы вкуса и индивидуальных предпочтений, и что даже худшие из них наверное лучше, чем вообще ничего.

Тем не менее, мы должны знать еще об одном пункте сравнения: так же, как не бывает богословски нейтрального перевода, поэтому не является богословски нейтральным лекционарием. Это особенно верно для трехлетних лекций, опубликованных за последние тридцать лет.Созданные комитетами с определенным богословским уклоном, эти лекционеры часто демонстрируют повестку дня, которая иногда оказывается в противоречии с конфессиональное лютеранство. Учитывая это, возможно, стоит пересмотреть использование Исторического лекционария. Его использование было традицией, которая объединила поколений христиан, и тот, который, возможно, был слишком быстро отвергнут. Это не означает, что использование трехлетнего лекционария не позволит вам проповедовать Христа распятого и таким образом отправить свою паству в ад.Это для сказать, что у этих лекций есть слабости, о которых мы должны знать, и за которые те, кто их использует, должны будут компенсировать.

Какой лекционарий мы используем (или используем ли мы лекционарий, если уж на то пошло) безусловно, адиафоран, но это не делает его неважным. Таким образом, выбирая лекционарий для богослужения, мы должны помнить мы выбираем катехизический инструмент. Лекционарий должен быть больше, чем средством раздавать отрывки из Писания, это должен быть путь понимания, руководство как для пастора, так и для паствы через весь совет Божий.Руководствуясь употреблением хорошего лекционария, наша вера хорошо питается, и мы расти в нашей вере и в нашем понимании нашего Господа. Слава Богу за Его радостная весть!

Соли Део Глория!


Сноски/Концевые сноски:

  1. Неемия 8:8 является хорошим примером этого, поскольку микра используется дважды. в стихе по одному разу с каждым значением. «Они читают ( vayiqr’u ) в отличие от книги, в Законе Божьем; и они дали смысл, и помог им понять чтение ( bamiqra ).»
  2. Эти еженедельные подразделения назывались sedarim , и вы найдете их на правых полях Biblia Hebraica. Начало каждой секции маркируется самех . В Вавилоне традиция стали читать Тору каждый год, и таким образом появились новые деления. настроить, парашот . Они отмечены под самех . с параш .
  3. Робертс, Александр и Дональдсон, Джеймс, ред. Доникейский Отцы. Американское издание. Нью-Йорк: Христианская Литературная Компания, 1906. И. п. 186.
  4. Это может быть происхождение литургических произведений, таких как Ave Maria .
  5. Технически перикоп является либо указателем показаний для церковного года (например, стр. 199-203 в ELH) или один из вариантов в нем лекционарий — это книга, в которой написаны все чтения вне. Сегодня lectionary используется в обоих значениях и pericope запрещено использовать только в таких документах, как этот.
  6. Сегодня лекционеры не так важны для литургических исследований как текстология, так как они играли огромную роль в передаче текст Нового Завета. Вытащите свой греческий NT и обратите внимание, сколько раз вы видите « Lect. » или « l » в критических аппарат. Сегодня сохранилось около 2000 из них, вторая по величине группа рукописей.
  7. Если вы похожи на меня и история ранней церкви несколько размыта, Джером жил с. 342420.Таким образом, если Джером действительно написал , то получается приписываемых для него она могла датироваться уже 382 годом (дата, когда он начал работать секретарем Папы Дамасия). Важность того, написал ли Джером Приходит Hieronymi знаменателен тем, что если он действительно пришел из Джерома, может быть, он просто копировал более ранний лекционарий, делая исторический лекционарий еще более историчен (т. е. является ли он продуктом Ранняя церковь или раннее средневековье?). Вы можете смело думать об этом как о литургический эквивалент дебатов о Северной и Южной Галатии.
  8. Сакраментарий был алтарной книгой средневековья. Он содержал перикопа, атрибуты церковного года, ряд месс и некоторые другие молитвы. Было произведено три очень важных таинства: Леонин, Геласиан и Григориан. Несмотря на то, что они носят имена знаменитые папы (Лев Великий, 440 461; Геласий I, 492 496; и Григория Великого, 5), мы точно не знаем, кто их составил. Однако каждая из них основывалась на предыдущей и вместе служила для стандартизации. обряды богослужения в Западной церкви.В 11 веке кто-то будет получить блестящую идею собрать портативную версию сакраментария и родится миссал.
  9. Алкуин (ок. 735804) был английским священнослужителем, который служил советником к Карлу Великому. Он был главной силой Каролингского Возрождения, который подготовил бы почву для Ренессанса.
  10. Хотя только на Тридентском соборе Римская церковь фактически усилил и стабилизировал его использование.
  11. Лютер, Мартин. Произведения Лютера: Литургия и гимны. американский Версия. Гельмут Т. Леманн, изд. Филадельфия: Fortress Press. 1965. Том. 53. с. 23ф.
  12. ср. там же, с. 68ф.
  13. Статья XXVI, ELH с. 21.
  14. Извинения, XXIV.1
  15. Это тот, что в The Lutheran Hymnary и Evangelical Лютеранский гимн. Вы заметите, что первый год — это Исторический лекционарий.
  16. Хорошим примером этого может быть Perikopenbuch zur Orduning. der Predigttexte , Берлин: Lutherisches Verlagshaus, 1966, который предоставил шесть серий текстов для использования в качестве проповеднических текстов в связи с обычные уроки Ветхого Завета, Послания и Евангелия.Немного доступнее (и на английском языке) — это текстов проповедей Эрнста Вендланда . Милуоки: северо-запад Издательство. 1984. На с. 10 он намекает на то же самое.
  17. Оба эти молитвенных часа превосходны, и их стоит иметь не только для семейное богослужение, а для подготовки проповедей, вызовов по болезни и богослужений для преподавателей. Предательство Лааше в настоящее время распродано (Кирие Элейсон!), однако Профессор Марк ДеГармо работает над ее новым переводом (Te Deum Laudamus!).Наставление Лютера на самом деле представляет собой сборник выдержек из писаний и проповеди Лютера, сделанные проф. Джордж Линк в 1877 году. Недавно был переведен на английский язык проф. Джоэл Бейсли, и последнее, что я проверял, было можно приобрести в книжном магазине Бетани. Также стоит упомянуть несколько сокращенная версия молитвы Лютера под названием Лютер для занятых Man , напечатано Лютеранской церковью в Австралии.
  18. Посмотрите любой лютеранский сборник гимнов, и, скорее всего, там будет число, близкое к 30%.«Приди, драгоценный выкуп, приди», «Подними головы, О, могучие врата», «О, как я приму тебя», «Проснись! Наступает долгожданный день», «Пришествие нашего короля», «О Невеста Христова, радуйся», «Восстань, чада Царствия», все открыто ссылаются на триумфальный въезд. Это может не показаться большой процент, но этого было достаточно, чтобы, когда ILCW планировал своих адвентистских чтений они были вынуждены включить эту запись в качестве альтернативной. чтение для Адвента 1.
  19. См. Приложение А
  20. Некоторые предполагают, что обычай совершать ежедневные службы может также объяснить это, но факты говорят об обратном.У лютеранина в городской церкви практика была бы такой: воскресная утренняя месса, где пастор проповедовал на уроке евангелия, затем воскресная вечерня, где он проповедовал о послании; в понедельник и вторник у него бы была заутреня и проповедовали по катехизису, утреня по средам была бы серией на св. Матфея или иногда на другой синоптический; Занятия по четвергам и пятницам из посланий, затем субботняя вечерня с проповедью евангелия Джона. Таким образом, службы следовали больше шаблону, чем любая перикопа. (с.ф. сочинений Лютера, том. 53, с. 68 и далее). Плюс услуги в будние дни на них смотрели так же, как на ежедневную часовню в колледже Бетани. В то время как принимался весь приход, эти службы совершались специально для в интересах студентов и преподавателей.
  21. Наш Синод направил на это первое заседание наблюдателей: проф. Джулиана Андерсона, Пр. Эйвинд Унсет и г-н Стэнли Ингебретсен. (Отчет Синода 1966 г.).
  22. Технически Евангелическо-лютеранская церковь в Канаде была частью этих производств с самого начала как округ Канады ALC.Позже, когда они стали независимыми, они присоединились к ILCW как независимая организация. тело.
  23. Современное поклонение 6: Церковный годовой календарь и лекционарий. Подготовлено Межлютеранской комиссией по богослужению. Миннеаполис: Аугсбург Издательство; Филадельфия: Издательский совет лютеранской церкви в Америке; Сент-Луис: Издательство Concordia, 1973. с. 13.
  24. Современное поклонение 6 , с. 14.
  25. Современное поклонение 6 , с.16.
  26. Современное поклонение 6 , с. 17.
  27. Версия Christian Worship на самом деле имеет некоторые незначительные вариации. в чтениях.
  28. В своей книге Писание и память: Вселенская герменевтика трехлетние лекционарии (Колледжвилль, Миннесота: The Liturgical Press, 1997), д-р Фриц Уэст довольно подробно разъясняет Писание и лекции. как то, что передает «общие воспоминания» церкви.
  29. Пересмотренный общий лекционарий: консультации по общим текстам. Wood Lake Books, Inc., Уинфилд, Британская Колумбия, Канада. 1992., с. 16.
  30. там же, с. 76.
  31. Эвансон, Чарльз, «Исследование пересмотренного общего лекционария». Обзор для Комиссии LC-MS по поклонению. Январь 1996 г. с. 6.
  32. Пересмотренный Общий Лекционарий , с. 78.
  33. Полный список упущений и правок см. в Приложении B.

Приложение А

Организация исторического лекционария

Жаль, что организация и темы Исторического лекционария часто упускают из виду, так как знание их может помочь в работе пастора и может помочь прихожанам в их богослужении.Пастор, который знает, как совместная работа по воскресеньям в течение сезона может эффективно использовать эту информацию в планировании служб и его проповедей. Прихожанин, которому рассказывают тема конкретного воскресенья может начать понимать, что такое гимны, интроить, собирать постепенно и читать о чем говорят (это особенно полезно для детей). Сильная тематическая организация Исторического Лекционарий, возможно, является его самым большим преимуществом, особенно когда его часто не хватает. в других лекционных системах.

Полностью рассмотреть организацию Исторического лекционария выходит за рамки этой статьи, но один пример не является. В историческом Лекционарий, сезоны Рождества и Крещения связаны и дополняют друг друга. друг друга: Рождество посвящено тому, как Бог становится человеком, Крещение – откровению что этот человек — Бог.

  Воскресенье   Тема   Евангелие
Рождество Слово, ставшее плотью ул.Луки 2:114, Рождение Христа
 Рождество 1  Обещание выполнено  Св. Луки 2:3340, Симеона и Анны
 Рождества 2  Божья милостивая защита  Св. Матфея 2:1323, Бегство в Египет
 Богоявление  Визит волхвов  Св. Матфея 2:112, Посещение волхвов
 Богоявление 1  Сын Божий ул.Луки 2:4152, Мальчик Иисус в храме
 Богоявление 2  Владыка радости  Св. Иоанна 2:111, Первое чудо
 Богоявление 3  Спаситель народов Св. Матф. 8:113, Иисус исцеляет прокаженного и слугу сотника
 Богоявление 4  Владыка природы Св. Матф. 8:2327, Иисус успокаивает бурю
Преображение  Преображение Господне ул.Мэтт. 17:19, Преображение

В Рождество мы слышим, что Бог стал человеком, в следующее воскресенье мы послушайте, как это является исполнением Божьего обетования. Мало того, мы слышим Симеон намекает на смерть Иисуса, а урок евангелия заканчивается стихом, рассказывающим нам, что Иисус «рос и укреплялся». Рождество 2 затем рассказывает Бегство в Египет. Бог рождается, Он подвержен смерти, и действительно в Его слабость должна ускользнуть от Ирода, чтобы Его не убили. Христос был «истинным человеком».

Затем наступает Богоявление, чье внимание на самом деле не так много, как Иисус пришел спасти язычников, но слава Божия явилась во Христе. Волхвы следуют за началом поклонения Ему, мальчик Иисус свидетельствует о том, что о деле Его Отца», затем первое чудо, затем исцеление болезни, затем успокоение бури. Каждая учетная запись показывает божественность Иисуса, и каждый больше, чем предыдущий, до полной божественности Иисуса воссияет при Его Преображении. Несколько лет у вас также есть Богоявление 5, чтением которого является притча о плевелах среди пшеницы, заканчивающаяся Иисус говорит, что Он Судья всей земли, Который повергнет плевелы в огонь и собери пшеницу в житницу Свою.

Теперь сравните это с организацией ILCW. Тема кажется сохранить на Рождество, а Крещение от Рождества отделить, начиная с Крещения Господня, за которым следует подборка рассказов от раннего служения Иисуса. Другими словами, становится немного больше чем более короткая версия сезона Пятидесятницы.

 

  Серия А, 1 год Серия B 2 года Серия C, 3 года
Эпизод  Мф 2:1-12 Волхвы поклоняются Иисусу  Мф 2:1-12 Волхвы поклоняются Иисусу   Мф 2:1-12 Волхвы поклоняются Иисусу
Поп 1 / Крещение  Мф 3:13-17 Иоанн крестит Иисуса Мк 1:4-11 Иоанн крестит Иисуса  
Эпизод 2      
Эпизод 3      
Эпизод 4      
 Эпизод 5      
 Эпизод 6      
 Эпизод 7      
 Ep 9 / Transfig      

Для дальнейшего изучения организации Исторического лекционария я хотел бы предложить попытаться найти эти книги («попробовать найти», потому что большинство распроданы):

Бэкер, Брюс Р. Лютеранское богослужение (программа курса). Новый Ульм, Миннесота: Колледж доктора Мартина Лютера, 1988.

.

Герке, Ральф. Планирование служения: рабочая тетрадь для пасторов, органистов и хормейстеры. Форт-Уэйн, Индиана: Concordia Theological Seminary Press. Это все еще может быть доступно.

Хорн, Эдвард Т. Христианский год. Филадельфия: Muhlenberg Press. 1957.

Линдеманн, Фред. Проповедь и прочее. 4 тт. Святой Луи: Издательство Конкордия, 1958 год.Это особенно хороший набор, и хорошо стоит найти. Наброски его проповедей часто носят благочестивый характер, но он прекрасно работа, показывающая, как все свойства работают вместе, чтобы улучшить тему обоих сезон и воскресенье. Он также включает проповеди лютеранских отцов. на малых праздниках.

Реунинг, Дэниел Г., изд. Рабочая тетрадь церковного года. Форт-Уэйн, Индиана: Конкордия Издательство Духовной семинарии. Это все еще может быть доступно, позвоните в Concordia-Ft. Книжный магазин Уэйн.


Приложение B

Упущения и правки ILCW/RCL

Упущения и правки перечислены по годам.На диаграмме те общие как в ILCW, так и в RCL. Ниже диаграммы приведены те, которые встречаются только в РКЛ. Если показание указано как пропущенное, оно было включено в предыдущую версия лекционария, а затем удалена или просто исключена из чтение, следуя рекомендациям редакции. руководство дается в скобках после выбора.

 

Серия А

Воскресенье   Урок   Проблема
Одолжен 1 Быт 3:1-7  Опущены ст. 8–15, поэтому Бог не разговаривает с Адамом и Евой.Еще более странным является пропуск 3:15. (vss 8-15 появляются позже в Proper 5 Б)
Троица Быт. 1:1–2:3  Хотя 2:3 является естественным концом, имейте в виду, что историческая критика рассматривает остальную часть Gen 2 как вторую учетную запись создания. Обратите внимание, что RCL включает т. 4 в их прочтении. ILCW также предоставляет Deut. 4:32-34, 39-40 в качестве альтернативы чтение, хотя это, вероятно, потому, что он короче.
Пен. 2/пред. 4 Мт 7:(15-20) 21-29  ILCW допускает пропуск стиха 15, «остерегайтесь лжепророков.» RCL просто начинается с v. 21.
Pent. 21/Предложение 23  Мф 22:110  Пропустить последние три стиха урока, где король выбрасывает человек без брачной одежды, и которые содержат «Ибо многие званые, но мало избранных». Это, безусловно, упрощает текст. проповедовать, но должны ли мы на самом деле редактировать притчи Иисуса? Кроме того, редактирование показывает более высокое критическое понимание притчи, пытаясь чтобы провести параллель с Луки 14:1624.

RCL Упущения и правки

 

Первое воскресенье Великого поста, опустить Рим. 5:12-15: «Поэтому, как грех через одного человека вошел в мир, а через грех — смерть, и таким образом смерть пришла ко всем людям, потому что все согрешили, ибо прежде, чем был дан закон, грех был в мире. Но грех не считается, когда нет закон. Тем не менее, смерть царила от времен Адама до времен Моисея, даже над теми, кто не согрешил, нарушив заповедь, как это сделал Адам, который был образцом грядущего.Но дар не подобен посягательству. Ибо если преступлением одного человека погибли многие, то тем более Божие благодать и дар, явившийся по благодати одного человека, Иисуса Христа, излиться на многих!» (Чтобы преуменьшить первородный грех?)

 

Пятидесятница 14/Исх. 16, опустить Рим 11:13-15: «Я говорю с вами неевреи. Поскольку я апостол для язычников, я много министерство в надежде, что я смогу каким-то образом вызвать зависть и сохранить некоторые из них.Ибо если их отвержение есть примирение мира, чем будет их принятие, как не жизнью из мертвых?» (антисемит?)

 

Пропустить Рим. 13:1-7: «Каждый должен подчиняться правящим власти, ибо нет власти, кроме той, которую поставил Бог. Существующие власти установлены Богом. Следовательно, он кто восстает против власти, тот восстает против того, что Бог установил, и те, которые так поступают, навлекут на себя суд.Для правителей не держите ужас для тех, кто поступает правильно, но и для тех, кто поступает неправильно. Ты хочешь быть свободным от страха перед власть имущим? Тогда делай то, что правильно, и он похвалит вас. Ибо он Божий слуга, чтобы делать вам добро. Но если вы это сделаете ошибся, бойся, ибо не даром он носит меч. Он Божий слуга, агент гнева, чтобы наказать обидчика. Следовательно, необходимо представить властям не только из-за возможного наказания, но и по совести.Это также то, почему вы платите налоги, ибо власти суть рабы Божии, посвящающие все свое время управлению. Дайте каждому то, что вы ему должны: если вы должны налоги, платите налоги; если выручка, затем выручка; если уважать, то уважать; если честь, то честь.»

 

Пропустить Мф.23:37-39: «Иерусалим, Иерусалим, убивающий пророков и побить посланных к тебе, как часто Я хотел собрать твоих детей вместе, как наседка собирает цыплят под крылья свои, но Ты не был готовый.Вот, оставляется тебе дом твой в запустении. Ибо я говорю вам, вы будете не увидишь Меня снова, пока не скажешь: «Благословен Грядущий во имя Господа’». (Антисемит)

 

 

Серия В

Задача воскресного урока

Пасха 2 Деяния 3:13-15, 17-26 Пропущено ст.16: «Верою во имя Иисус, этот человек, которого ты видишь и знаешь, стал сильным. Это имя Иисуса и вера, которая приходит через Него, Который дал это полное исцеление ему, как вы все видите.»

Троицкое воскресенье Ин. 3:1-17 Странно, что это чтение используется на в это воскресенье, так как ILCW пожаловался, что чтение Иоанна было неадекватным на Троицу. Иди разберись.

пент. 9/пред. 11 Еф. 4:1–7, 11–16 ILCW опускает ст. 8–10, что может к непониманию этого текста.

пент. 16/Топ. 18 Иакова 2:1-10 (11-13) 14-17 раздел, осуждающий супружескую неверность.

Pent 20/Prop 22 Марка 10:2-16 Сюрприз! Они включают в себя раздел Марк осуждение развода.Иди разберись.

 

RCL изменил Пятидесятницу 8/Proper 10 с Марка 6:8-13: «Призывая Двенадцать Ему, Он послал их по двое и дал им власть над злые духи. Это были Его наставления: «Ничего не берите в дорогу кроме посоха — ни хлеба, ни сумки, ни денег в поясе. Носите сандалии, но не дополнительная туника. Всякий раз, когда вы входите в дом, оставайтесь там, пока не выйдете тот город. И если какое-либо место не будет приветствовать вас или слушать вас, встряхните пыль с ног ваших, когда будете уходить, во свидетельство против них.» Они вышли и проповедовали, что люди должны покаяться. Они изгнали многих демонов, и многих больных мазал маслом и исцелял их». скорее всего, миссионеры, призывающие людей к покаянию, сочли оскорбительными.)

 

Пропустить Еф. 5:22-31: «Жены, повинуйтесь своим мужьям»

 

 

Серия С

Задача воскресного урока

Богоявление 7 1 Кор. 15:35-38, 42-50 Пропущены ст.39-41: «Не всякая плоть одно и то же: у людей одна плоть, у животных другая, у птиц другая и ловить другую.Есть также небесные тела и есть земные тела; но великолепие небесных тел одно, и великолепие земные тела — другое. Солнце имеет один вид великолепия, луна другой и звезды другие; и звезда отличается великолепием от звезды». Вероятно, потому что это сложный раздел.

Великий пост 3 Исх 3:1-8а, 10-15 Единственная причина, по которой я могу думать, что они опустили vs 8b из-за жестких имен. Но зачем опускать против 9? «А теперь дошел до Меня вопль сынов Израилевых, и Я увидел, как Египтяне угнетают их.» BHS не перечисляет никаких текстовых проблем. Трудно проход?

Pent 4/Prop 6 2 Sam 11:26-12:10, 13-15 ILCW и RCL опустить vss 11-12, хотя это, вероятно, для того, чтобы сделать его более подходящим чтением для поклонения служение («Так говорит Господь: из дома твоего Я наведу на тебя беду. На твоих глазах я возьму твою жен и отдай тому, кто близок тебе, и он ляжет с твоим жены средь бела дня. Ты сделал это тайно, но я сделаю это средь бела дня перед всем Израилем.»

пент. 8/Prop 10 Лк 10:25-37 Стихи 23-24, вероятно, были включены в ранние церкви, чтобы убедиться, что эта притча была правильно понята как демонстрация нашей неспособности делать добро и полагаться на Евангелие. Vs 25 является естественной отправной точкой, но это также облегчает моралистическую интерпретацию этой притчи. На самом деле, в этот день в ILCW & RCL есть даже специальная коллекция: «Господи Боже, используй наши жизни, чтобы коснуться мира Твоей любовью. Духом Твоим, быть ближним нуждающимся, служа им с усердием сердца; по »

Pent 9/Prop 11 Gen 18:1-10a (10b-14) ILCW допускает пропуск последние 4 куплета RCL их просто вырезает.Это раздел, где Сара слушает у палатки и смеется над обещанием сына. Обратите внимание, что многие современные комментаторы Книги Бытия рассматривают этот раздел как интерполяцию, и говорят, что это несправедливо характеризует Сару. Так много для вдохновения.

 

RCL ВЗ чтение на Рождество 1, 1 Царств 2:1820, 26, довольно странный выбор для сегодняшнего дня. Я предполагаю, что они видели это как параллель с чтением мальчика Иисуса, но это смещает тему этого воскресенья с Христос о детях в Библии.

 

Вместо Великого поста 5, серия C, RCL заменяет Ин 12:1-8 на Лк 20:9-19 (притча собственника земли). Вероятно, это связано с тем, что учетная запись Lk направлена специально против евреев и является в высшей степени мессианским («Камень, который строители отвергнуты»). В 12-й главе Иоанна рассказывается о том, как Мария помазала Иисуса. ноги.

 

Для Пасхи 2 серии C чтением ILCW были Деяния 5:12, 1732. РКЛ это Деяния 5:2732. Очень вероятно, что это потому, что в стихе 12 говорится, что апостолы творили чудеса, а стихи 17-26 рассказывают об ангеле, освобождающем апостолов. из тюрьмы.Помните, что одна из целей RCL — удалить показания с «текстовыми трудностями».

 

Также на Пасху 2, где у ILCW было Откр. 1:418, RCL сокращает его. к Откр. 1:48. Vss 918 — св. Иоанн, созерцающий Христа Воскресшего, свидетельствуя о Его божественности и Его воскресении. «Не бойся. Я Я Первый и Последний. Я Живой; Я был мертв, и вот я я жив во веки веков! И я держу ключи смерти и ада.»

 

На Пасху 4 чтением ILCW были Деяния 13:15-16а, 26-33.Это было вероятно, сочли это несколько антисемитским, и Деяния 9:36-43 заменены на RCL (Доркас, в которой Питер воскрешает ее из мертвых).

 

Пасха 5, RCL заменяет хорошее чтение (Деяния 11:1-18) антисемитским. один (Деяния 13:44-52).

 

Пасха 6 RCL заменяет Деяния 16:9-15 на Деяния 14:8-18. Счет в Деяниях 14 Павел совершает чудо.

 

Пасха 7, в ILCW было Откр. 22:12-17, 20. В RCL есть Отк. 22:1214, 16-17, 20-21.Подозрительно, что оба опускают vss 18-19 («всех предупреждаю кто слышит слова пророчества книги сей: Если кто что добавит им Бог наложит на него язвы, описанные в этой книге. И если кто отнимет слова от этой книги пророчеств, Бог отнимет от ему свою долю в дереве жизни и в святом городе, которые описаны в этой книге».) Но повестка дня RCL становится очень ясной с их пропуск ст. 15 («Снаружи — псы, занимающиеся магией искусств, блудников, убийц, идолопоклонников и всех, кто любит и практикует ложь.»)

 

Чтение ILCW для Пятидесятницы 5/Proper 7 было Лк 9:18-24 (великое исповедание Петра). RCL опускает это чтение.

 

ILCW Пятидесятница 6/Правильная 8 — это 1 Царств 19:14-21. RCL исправляет это до 19:15-16, 19-21. В стихе 14 говорится, что дети Израиля оставили Божий завет, vss 17-18 — это Бог говорит Илии убить лжепророков.

 

Пятидесятница 7/Исходное 9 ПБК позволяет опустить Галатам 6:1-6 из чтение послания, раздел, в котором говорится о том, как обращаться с пойманным в грехе.

 

В уроке Евангелия в это воскресенье RCL опускает Луки 10:11-12, вероятно, потому что он говорит о последнем дне как о дне суда («он будет более терпимее в тот день для Содома, чем для того города [который отвергал всякую 72]»)

 

Пятидесятница 14 / Собственно 16, в ILCW есть Луки 13: 22-30, RCL заменяет Луку 13:10-17. 22-30 говорит о последнем дне как о дне суда, Иисус говорит «Приложите все усилия, чтобы войти через узкие врата». и т.д.

 

Пятидесятница 20/Настоящее 22, ILCW имеет Луки 17:1-10, RCL сокращается до 17:3-10.(Стихи 1-2: «Иисус сказал Своим ученикам: «То, что заставляет людей ко греху обязательно придут, но горе тому, через кого они приходят. Лучше бы его бросили в море с привязанным жерновом на шею, чем соблазнить одного из малых сих».) Может быть, они думали, что это интерполяция с Mt 18 (хотя UBS 4 не обратите на это внимание) или что, казалось, это не соответствовало разделу. В частности, Мф 18:1-10 (параллель к Лк 17:1-2) также отсутствует в ILCW и RCL.


Вернуться в Евангелическо-лютеранский гимн домой страница

Отправить письмо автору: Александр Звенеть

Экспериментальное метилирование ДНК, направленное на митохондрии, идентифицирует метилирование GpC, а не метилирование CpG, как потенциальный регулятор экспрессии митохондриального гена были получены от АТСС. OSE-C2 (иммортализованные эпителиальные клетки яичников человека

43 ), CiGenCs (условно иммортализованные гломерулярные эндотелиальные клетки человека 44 ), IHH (иммортализованные гепатоциты человека 45 ) и BEAS-2B ρ 0 эпителиальных клеток человека без мтДНК) были любезно предоставлены Dr.Ричард Эдмондсон, доктор Саймон Сэтчел, доктор Хан Мошаге и доктор Роланд Хоффманн соответственно.

CiGenCs и IHH культивировали в колбах, покрытых желатином, тогда как клетки BEAS-2B ρ 0 культивировали в колбах, покрытых коллагеном. Все клеточные линии, за исключением клеток IHH и BEAS-2B ρ 0 , культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (25 мМ глюкозы) (Lonza) с добавлением 10% FCS (Perbio Hyclone), 2 мМ L-глютамина (BioWhittaker) и 50 мкг/мл сульфата гентамицина (Invitrogen). Кроме того, среда IHH содержала 20 мЕд/мл инсулина (Novo Nordisk) и 50 нмоль/л дексаметазона (Sigma).Клетки BEAS-2B ρ 0 культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 25% FCS, 2  мМ L-глутамина, 1% P/S, 2,5 мкг/мл амфотерицина B (Sigma), 1× раствор аминокислот MEM. (Sigma), 1× раствор заменимых аминокислот MEM (Sigma), витамины (Sigma), 50 мкг/мл уридина (Sigma). Все клетки хранили во влажном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 °C.

Для обработки с высоким или низким содержанием глюкозы клетки дважды промывали PBS и культивировали в течение 4 дней либо в среде DMEM с низким (5  мМ), либо с высоким (25 мМ) уровнем глюкозы.

Клонирование

Все белки, нацеленные на митохондрии, были клонированы с использованием одной «исходной синтетической конструкции». Эта «основная синтетическая конструкция» была синтезирована в Bio Basic Canada и содержит (от 5′-конца к 3′-концу): 1. последовательность Козака; 2. N-концевой 49-аа сигнал митохондриальной локализации (MLS) субъединицы F1β митохондриальной АТФ-синтазы 46 ; 3. открытое положение 1; 4. HA-тег; 5. Гибкий линкер из 17 аминокислот – (SGGGG) 3 SS 46 ; 6. открытое положение 2 для эпигенетического фермента; 7.С-концевой 18-аа сигнал ядерного экспорта (NES) неструктурного белка 2 минутного вируса мышей 47 ; 8. стопкодон. Добавление рестрикционных ферментов между отдельными компонентами позволило гибко клонировать митохондриально-направленные белки: BamHI – Kozak – MLS – NruI AvrII – Открытая позиция 1 – BsIWI NruI – HAtag – гибкий линкер – EcoRV AscI – открытое положение 2 – PacI EcoRV – NES – стопкодон – NotI .Эту основную конструкцию субклонировали в pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (CD511B-1) с использованием сайтов рестрикции BamHI и NotI (System Biosciences). В этой плазмиде EF1-copGFP заменяли на устойчивость к SV40-пуромицину с использованием ферментов рестрикции NotI и XhoI. Дополнительный NES был клонирован в окончательную конструкцию. Более того, «открытая позиция 1» была удалена с помощью расщепления NruI. Для визуализации плазмиды те же рестрикционные ферменты использовали для субклонирования mCherry в «открытое положение 1». Все конструкции, как описано ниже, были клонированы в эту плазмиду.В качестве отрицательного контроля с использованием расщепления EcoRV была создана конструкция без эффекторного домена (NoED), не содержащая белка в «открытом положении 2».

DNMT1

Для получения продукта ПЦР митохондриально-направленного варианта транскрипта DNMT1 (mtDNMT1) из эталонной кДНК человека (Clontech, рандом-праймированная) или случайно-праймированного пула кДНК клеточных линий человека (HEK293T, HCT116, HeLa, Использовали IHH, SiHa, Caski, SKOV3, HepG2, C33A, OSE-C2), праймеры ( BclI -mtDNMT1- NotI ), как описано в таблице 1.Амплификация mtDNMT1 оказалась безуспешной, несмотря на использование широкого спектра стратегий: использовались разные ДНК-полимеразы в соответствии с протоколом производителя (ДНК-полимераза высокой точности Phusion (Thermo Scientific), ДНК-полимераза Pfu (Thermo Scientific), ДНК-полимераза Taq). (Thermo Scientific)), состав ПЦР-смеси варьировался (тип буфера, концентрация MgCl 2 , добавление ДМСО), разные протоколы ПЦР (температура плавления, время элонгации, количество циклов и т.) прошли испытания. Поэтому, в качестве альтернативы, кодирующая последовательность нормального (не нацеленного на митохондрии) гена DNMT1 (кДНК-клон MGC:161505 IMAGE:89) была получена с использованием праймеров ( AscI -DNMT1- PacI ), как описано в таблице 1. Для достижения митохондриального нацеливания DNMT1 этот продукт ПЦР был клонирован в синтетическую конструкцию pCDH-CMV-master-SV40-puro с использованием сайтов рестрикции AscI и PacI, в результате чего был получен MLS1x-HAtag-гибкий линкер-DNMT1-2xNES. .

М.SssI, M.CviPI, hM.CviPII и

E . coli промотор conII

Плазмида, содержащая M.SssI 48 и ее каталитически неактивный двойной мутант (E186A, R230A), M.SssI∆∆ 30 , была ранее получена от доктора Антала Кисса. Плазмиды, содержащие M.CviPI 31 и hM.CviPII 32 , были любезно предоставлены доктором Майклом Кладде. До того, как нечеловеческие ДНК-метилтрансферазы были клонированы в синтетическую конструкцию pCDH-CMV-master-SV40-puro, E .Промотор coli conII был включен в обратной ориентации сразу за NES. Это было сделано путем отжига комплементарной пары олигонуклеотидов, содержащих conII и расщепленные фрагменты NotI (таблица 1). Короче говоря, эквимолярные концентрации прямого и обратного олигонуклеотидов смешивали с буфером NEB 4 и инкубировали на водяной бане при 95°С в течение 5 мин. Отключив водяную баню, олигонуклеотиды медленно остыли до комнатной температуры. Отожженные олигонуклеотиды использовали в последующих процедурах клонирования.Конвергентная транскрипция conII относительно гена ДНК-метилтрансферазы снижает токсичность из-за дырявой экспрессии даже в E . штаммы coli без рестрикции, зависящей от метилирования 49 . Субклонирование M.SssI с использованием ферментов рестрикции AscI и PacI или продукта ПЦР M.CviPI и hM.CviPII, содержащих сайты рестрикции AscI и PacI, позволило получить синтетическую конструкцию pCDH-CMV-master-conII-SV40-puro, содержащую MLS1x. -HAtag-гибкий линкер-(M.SssI/M.CviPI/hM.CviPII)-2x РЭШ. Все конструкции были подтверждены ПЦР колоний и секвенированием (Baseclear). Трансформацию плазмид, содержащих нечеловеческие DNMT, проводили в E . coli клеток ER1821, все остальные проводили в клетках E . coli Top10 клеток.

Вирусная доставка конструкций, нацеленных на митохондрии

Лентивирусные частицы, содержащие конструкции, нацеленные на митохондрии, были получены, как описано ранее 50 .Вкратце, упаковочные клетки HEK293T котрансфицировали с использованием кальций-фосфатного метода с плазмидами, содержащими ATF, и вирусными упаковочными плазмидами, содержащими gag/pol и G-белок вируса везикулярного стоматита в соотношении 3:2:1. Вирусный супернатант собирали через 48 ч и 72 ч после трансфекции и использовали в сочетании с 6 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich) для заражения клеток-хозяев C33A и HCT116. Через три дня после трансдукции были получены стабильные клеточные линии с использованием селекции 1 мкг/мл пуромицина (Sigma) в течение 5 дней.Среду для селекции обновляли каждые 2 дня.

Праймеры для проверки

Все праймеры, используемые для амплификации мтДНК, были подтверждены на агарозном геле для специфической амплификации мтДНК, а не так называемых NUMT, ядерных копий мтДНК. Для этого в качестве отрицательного контроля использовали ДНК клеток BEAS-2B ρ 0 , не содержащих мтДНК. Для каждой пары праймеров q(RT)-PCR была построена стандартная кривая для расчета эффективности пары праймеров (Рис. 4 в Приложении).

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Тотальную РНК выделяли с использованием набора для очистки РНК GeneJET (Thermo Scientific) в соответствии с протоколом производителя, включая дополнительную 15-минутную обработку ДНКазой I (Roche) для удаления загрязнения ДНК.РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием случайных гексамерных праймеров с помощью набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Каждая реакция qRT-PCR содержала 500 нМ каждой пары праймеров, 10 нг кДНК и 1xABsolute qPCR SYBR Green, Rox Mix (Thermo Scientific). Праймеры были заново разработаны, извлечены из банка данных праймеров для ПЦР в реальном времени (RTPrimerDB, http://medgen.urgent.be/rtprimerdb/) или получены из литературы 23, 51, 52 (таблица 1).Реакции qRT-PCR проводили на ViiA7 Real time PCR (Applied Biosystems) в течение 15 минут при 95 °C, затем следовали 40 циклов по 15 секунд при 95 °C, 30 секунд при 60 °C и 30 секунд при 72 °C. В качестве гена домашнего хозяйства использовали β-актин. Данные и кривые плавления анализировали с использованием программного обеспечения ViiA7 RUO, а относительную экспрессию по сравнению с контролями рассчитывали с использованием метода ∆∆Ct 53 .

Выделение ДНК

Лизис клеток проводили раз в сутки при 55°C в лизирующем буфере TNE (10 мМ Трис/HCl, pH 7.5; 150 мМ NaCl; 10 мМ ЭДТА; 1% SDS) и 100 мкг протеиназы К. На следующий день ДНК выделяли, как описано ранее 50 . Короче говоря, лизированные клетки перемешивали в течение 15 с. насыщенным (6 M) NaCl в соотношении 5:1. Эту смесь смешивали с равным объемом хлороформа/изоамилового спирта (24:1) и перемешивали в течение 60 мин. на роторе с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 10 000 об/мин при 4°С. Тотальную клеточную ДНК (геномную и митохондриальную ДНК) экстрагировали, используя хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), РНКазу А (Thermo Scientific), обрабатывали в течение 1 ч при 37°С и осаждали изопропанолом.Количественное определение ДНК проводили с использованием спектрофотометра Nanodrop 1000 (Thermo Scientific).

Число копий митохондриальной ДНК (мтДНК) и образование праймера ДНК 7S

10 нг общей клеточной ДНК использовали в качестве исходных данных для количественной ПЦР. Были использованы праймеры, амплифицирующие область яДНК (β-актин) и область мтДНК (D-петля) (таблица 1). Для проверки использовали независимую пару праймеров мтДНК области mtCOX1. Реакции кПЦР проводили на ПЦР в реальном времени ViiA7 (Applied Biosystems) в течение 15 мин при 95°С, затем следовали 40 циклов по 15 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С.{\ast {\rm{праймер}}{\rm{эффективность}}})\).

Бисульфитное секвенирование

400 нг ДНК подвергали бисульфитной конверсии с использованием набора EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР с бисульфитом D-петли 13 и mtCOX2 7 проводили с использованием специфичных для бисульфита праймеров (таблица 1), как описано ранее 7, 13 . Продукты ПЦР клонировали в вектор pCR4-TOPO (Thermo Scientific) и отдельные клоны отправляли на секвенирование.Результаты бисульфитного секвенирования были проанализированы с использованием онлайн-инструмента QUMA (www.quma.cdb.riken.jp/) 55 .

Иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP)

Для каждой иммунопреципитации 1 мкг общей клеточной ДНК обрабатывали ультразвуком с использованием Bioruptor Pico (20 циклов: 20 дюймов включено, 40 дюймов выключено). Иммунопреципитацию ДНК 5 mC проводили с использованием набора для захвата метилированной ДНК Methylamp (Epigentek) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве отрицательного контроля выполняли иммунопреципитацию ДНК с использованием нормального мышиного антитела IgG.Обогащение 5 mC в конкретных областях мтДНК анализировали с использованием праймеров для D-петли , mtCYTB , mtCOX2 (как описано ранее в ссылке 18, Таблица 1).

Конфокальная микроскопия

Локализация слитой конструкции M.SssI, нацеленной на митохондрии mCherry, была визуализирована с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (объектив Leica SP8, HC PL APO CS2 63×/1,4). Следуя рекомендациям производителя, для окрашивания митохондрий клетки обрабатывали 100 нМ Mitotracker Deep Red FM (Molecular Probes) в течение 30 мин при 37 °C.Нацеленный на митохондрии слитый белок mCherry M.SssI возбуждали с помощью лазерного излучения с длиной волны 552 нм, а Mitotracker Deep Red возбуждали с помощью лазерного излучения с длиной волны 633 нм.

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в буфере для ресуспендирования (100 мМ NaCl, 15 мМ MgCl 2 , 100 мМ Трис, pH 7,5) и инкубировали на льду в течение 10 мин при регулярном встряхивании. Образцы гомогенизировали путем 5-кратной промывки клеток через иглу G25. Затем фракции ядерных (NER) и митохондриальных (MER) белков собирали с помощью дифференциального центрифугирования 56 .Количественное определение белка проводили с помощью набора DC BioRad Protein Assay (BioRad). 50 мкг белка наносили на 12% гель SDS-PAGE для обнаружения конструкции, нацеленной на митохондрии (содержащей HAtag). Блоты блокировали на 1 ч 5% обезжиренным молоком в ТБС. Для обнаружения первичные антитела инкубировали O/N при 4 °C, тогда как вторичные антитела инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Использовали следующие антитела: 1:1000 мышиных анти-HAtag (HA.11, Biolegend), 1:1000 кроличьих анти-VDAC1/поринов (Ab34726, Abcam), 1:1000 мышиных анти-ламина B1 (клон L5, Invitrogen). и конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи антимышиные (P0260, Dako) и свиные антикроличьи (P0217, Dako) 1:1000.Сигнал вестерн-блоттинга генерировали с помощью субстрата вестерн-блоттинга Pierce ECL Plus (Thermo Scientific) и регистрировали с помощью системы визуализации Biorad ChemiDoc MP (Biorad).

Метаболическая активность митохондрий

Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 3200 клеток на лунку. Анализ MTS использовался для определения митохондриальной метаболической активности и клеточной пролиферации 57 . Короче говоря, через один день (для митохондриальной метаболической активности) или четыре дня (для клеточной пролиферации) после посева в каждую лунку добавляли раствор CellTiter 96 Aqueous One (Promega) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С.Затем определяли оптическую плотность при 490 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов Versamax (Molecular Devices). При измерении поглощения через один день после посева одинакового количества клеток любое различие в поглощении может быть объяснено только различием в митохондриальной метаболической активности, тогда как через четыре дня после посева любое различие в поглощении может быть результатом различий в митохондриальной метаболической активности и клеточной активности. пролиферация/жизнеспособность клеток.

Митохондриальная продукция АФК

Уровни митохондриального супероксида определяли с помощью зонда MitoSOX Red ROS.Клетки дважды промывали DMEM без фенолового красного и инкубировали с 5  мкМ MitoSOX Red в DMEM без фенолового красного в течение 30 минут при 37 °C. После обработки клетки обрабатывали трипсином и собирали для измерений FACS (BD LSR-II, BD Biosciences) с использованием УФ-лазера 355 нм в сочетании с фильтром 575/26 нм 58 . В качестве положительного контроля клетки обрабатывали 100 мкМ менадиона в течение 1 часа при 37 °С.

Анализ гибели клеток

Как описано ранее 59 , чувствительность к АФК-индуцированной гибели клеток определяли с использованием иодида пропидия (PI) в качестве маркера для поздних апоптотических/некротических клеток.Клетки окрашивали в течение 10 мин 5 мкг/мл PI (Sigma-Aldrich) в PBS при 4 °C в темноте. Флуоресценцию PI измеряли с использованием канала FL-3 проточного цитометра FACScalibur (Beckton Dickenson Biosciences). Процент PI-положительных клеток определяли с помощью программного обеспечения Kaluza 1.2 (Beckman Coulter), а графики строили с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5 (GraphPad Software Inc.).

Статистический анализ

Все эксперименты проводились трижды, если не указано иное. Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5.Одногрупповые и многогрупповые сравнения проводились с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным критерием Даннета, соответственно. Значение p 0,05 или меньше считалось статистически значимым (*p ≤ 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001).

Парадоксальная роль глипикана-1 в росте клеток рака предстательной железы и опухоли

  • 1.

    Фико, А., Майна, Ф. и Доно, Р. Тонкая настройка передачи сигналов клетками с помощью глипиканов. Клеточные и молекулярные науки о жизни: CMLS 68 , 923–929, https://doi.org/10.1007/s00018-007-7471-6 (2011).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 2.

    Filmus, J., Capurro, M. & Rast, J. Glypicans. Биология генома 9 , 224, https://doi.org/10.1186/gb-2008-9-5-224 (2008).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 3.

    Fransson, L. A. и др. .Новые аспекты глипикановой гликобиологии. Клеточные и молекулярные науки о жизни: CMLS 61 , 1016–1024, https://doi.org/10.1007/s00018-004-3445-0 (2004).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 4.

    Gutierrez, J. & Brandan, E. Новый механизм секвестрации фактора роста фибробластов 2 глипиканом в липидных рафтах, обеспечивающий дифференцировку скелетных мышц. Mol Cell Biol 30 , 1634–1649, https://doi.org/10.1128/MCB.01164-09 (2010 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 5.

    Мацуда, К. и др. . Глипикан-1 сверхэкспрессируется при раке молочной железы человека и модулирует митогенные эффекты множественных гепарин-связывающих факторов роста в клетках рака молочной железы. Исследование рака 61 , 5562–5569 (2001).

    КАС пабмед Google Scholar

  • 6.

    Sethi, JK & Vidal-Puig, A. Передача сигналов Wnt и контроль клеточного метаболизма. Biochem J 427 , 1–17, https://doi.org/10.1042/BJ200 (2010).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 7.

    Суховских А.В. и др. . Экспрессия протеогликанов в нормальной ткани предстательной железы человека и раке предстательной железы. ISRN Oncol 2013 , 680136, https://doi.org/10.1155/2013/680136 (2013 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 8.

    Huang, G., Ge, G., Izzi, V. & Greenspan, D. S. Цепи альфа3 коллагена типа V регулируют рост опухоли молочной железы посредством глипикана-1. Nat Commun 8 , 14351, https://doi.org/10.1038/ncomms14351 (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 9.

    Peters, MG и др. . Ингибирование инвазии и метастазирования глипиканом-3 в сингенной модели рака молочной железы. Лечение рака молочной железы 80 , 221–232, https://doi.org/10.1023/A:1024549729256 (2003).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 10.

    Клефф, Дж. и др. . Стабильная трансфекция антисмысловой конструкции глипикана-1 снижает онкогенность клеток карциномы поджелудочной железы PANC-1. Поджелудочная железа 19 , 281–288 (1999).

    КАС Статья Google Scholar

  • 11.

    Чжу, Д. и др. . Новый глипикан-3-связывающий пептид для in Vivo Флуоресцентная визуализация гепатоцеллюлярной карциномы. Bioconjug Chem 27 , 831–839, https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00030 (2016).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 12.

    Чжан, К. и др. . Прогностическое значение экспрессии GPC5 у больных раком предстательной железы. Tumor Biol 37 , 6413–6418, https://doi.org/10.1007/s13277-015-4499-3 (2016).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 13.

    Truong, Q. и др. . Глипикан-1 как биомаркер рака предстательной железы: выделение и характеристика. J Рак 7 , 1002–1009, https://doi.org/10.7150/jca.14645 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 14.

    Эдвардс, И. Дж. Протеогликаны при раке предстательной железы. Нат Рев Урол 9 , 196–206, https://doi.org/10.1038/nrurol.2012.19 (2012).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 15.

    Лу, Х. и др. . Повышенная экспрессия глипикана-1 связана с неблагоприятным прогнозом при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. Cancer Med 6 , 1181–1191, https://doi.org/10.1002/cam4.1064 (2017).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 16.

    Сайто, Т. и др. . Высокая экспрессия глипикана-1 предсказывает диссеминацию и неблагоприятный прогноз при глиобластомах. Всемирный нейрохирург , https://doi.org/10.1016/j.wneu.2017.05.165 (2017).

    Артикул Google Scholar

  • 17.

    Хо, М. и Ким, Х. Глипикан-3: новая мишень для иммунотерапии рака. Eur J Рак 47 , 333–338, https://doi.org/10.1016/j.ejca.2010.10.024 (2011).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 18.

    Hsu, H.C., Cheng, W. & Lai, P.L. Клонирование и экспрессия транскрипта MXR7, регулируемого развитием, при гепатоцеллюлярной карциноме: биологическое значение и пространственно-временное распределение. Исследование рака 57 , 5179–5184 (1997).

    КАС пабмед Google Scholar

  • 19.

    Ким Х. и др. . Протеогликан гепарансульфата GPC3 является потенциальным супрессором опухоли легких. Американский журнал респираторных клеток и молекулярной биологии 29 , 694–701, https://doi.org/10.1165/rcmb.2003-0061OC (2003).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 20.

    Мурти, С. С. и др. . Экспрессия GPC3, рецессивного гена избыточного роста, сцепленного с Х-хромосомой, подавляется при злокачественной мезотелиоме. Oncogene 19 , 410–416, https://doi.org/10.1038/sj.onc.1203322 (2000).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 21.

    Xiang, Y.Y., Ladeda, V. & Filmus, J. Экспрессия Glypican-3 подавляется при раке молочной железы человека. Онкоген 20 , 7408–7412, https://doi.org/10.1038/sj.onc.1204925 (2001 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 22.

    Correia, A.L. & Bissell, M.J. Микроокружение опухоли является доминирующей силой при множественной лекарственной устойчивости. Обновление лекарственной устойчивости 15 , 39–49, https://doi.org/10.1016/j.drup.2012.01.006 (2012).

    КАС Статья Google Scholar

  • 23.

    Бисселл, М.J. & Hines, W. C. Почему у нас больше не бывает рака? Предлагаемая роль микроокружения в сдерживании прогрессирования рака. Nat Med 17 , 320–329, http://www.nature.com/nm/journal/v17/n3/abs/nm.2328.html#supplementary-information (2011).

  • 24.

    Бисселл, М. Дж. и Радиски, Д. Опухоли в контексте. Nat Rev Cancer 1 , 46–54, https://doi.org/10.1038/35094059 (2001).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 25.

    Чанг, Л. В. К., Бейсман, А., Ассикис, В. и Чжау, Х. Э. Молекулярный анализ прогрессирования рака предстательной железы: недостающее звено микроокружения опухоли. J Urology 173 , 10–20, https://doi.org/10.1097/01.ju.0000141582.15218.10 (2005).

    Артикул Google Scholar

  • 26.

    Перепел, Д. Ф. и Джойс, Дж. А. Микроокружающая регуляция опухолевой прогрессии и метастазирования. Nature Medicine 19 , 1423–1437, https://doi.org/10.1038/nm.3394 (2013 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 27.

    Муранен Т. Взаимодействия между клетками и клетками и матриксом. Молекулярная биология клетки 24 , 671–671, https://doi.org/10.1091/mbc.E12-12-0872 (2013).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 28.

    Макгрэйл, Д.Дж., Гош Д., Куах Н.Д. и Доусон М.Р. Дифференциальный механический ответ мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов на секретируемые опухолью растворимые факторы. PLoS One 7 , e33248, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033248 (2012 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 29.

    Ng, M. R. & Brugge, J. S. Жесткий удар стромы: перекрестное связывание коллагена способствует прогрессированию опухоли. Раковая клетка 16 , 455–457, https://doi.org/10.1016/j.ccr.2009.11.013 (2009).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 30.

    Sun, Y., Xu, K., He, M., Fan, G. & Lu, H. Гиперэкспрессия глипикана 5 (GPC5) ингибирует пролиферацию и инвазию клеток рака предстательной железы посредством подавления Sp1-опосредованной EMT и активация передачи сигналов Wnt/бета-катенина. Oncol Res , https://doi.org/10.3727/096504017X15044461944385 (2017).

    Артикул Google Scholar

  • 31.

    Клефф, Дж. и др. . Гепарансульфатный протеогликан глипикан-1 клеточной поверхности регулирует действие фактора роста в клетках карциномы поджелудочной железы и сверхэкспрессируется при раке поджелудочной железы человека. J Clin Invest 102 , 1662–1673, https://doi.org/10.1172/JCI4105 (1998).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 32.

    Quach, N.D. и др. . Роль рецептора фосфолипазы А2 в липосомальной доставке лекарств в клетки рака предстательной железы. Молекулярная фармацевтика 11 , 3443–3451, https://doi.org/10.1021/mp500174p (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 33.

    Пати, С., Инграм, Л. М., Сан, М. К., Вагнер, Дж. Дж. и Каммингс, Б. С. Локализация и экспрессия CTP: фосфохолинцитидилилтрансфераза в мозге крыс после воздействия кокаина. Журнал химической нейроанатомии 96 , 1–6, https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2018.10.006 (2018).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 34.

    Liang, C.C., Park, A.Y. & Guan, J.L. In vitro Анализ царапин: удобный и недорогой метод анализа миграции клеток in vitro . Nat Protoc 2 , 329–333, https://doi.org/10.1038/nprot.2007.30 (2007).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 35.

    Aljuffali, I. A. et al . Повышенная противоопухолевая активность низких доз непрерывного введения топотекана при раке предстательной железы. Биология и терапия рака 12 , 407–420 (2011).

    КАС Статья Google Scholar

  • 36.

    Шинделин, Дж. и др. . Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Природные методы 9 , 676–682, https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 37.

    Юсел, Б. и др. . Негативное прогностическое влияние костного метастазирования опухолевой массы. Clinics (Сан-Паулу) 70 , 535–540, https://doi.org/10.6061/clinics/2015(08)01 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 38.

    Putzke, A. P. и др. . Метастатическое прогрессирование рака предстательной железы и регуляция е-кадгерина киназами семейства zeb1 и SRC. Американский журнал патологии 179 , 400–410, https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2011.03.028 (2011).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 39.

    Аалинкил, Р. и др. . Сверхэкспрессия MMP-9 способствует инвазивности клеточной линии рака предстательной железы LNCaP. Иммунол Инвест 40 , 447–464, https://doi.org/10.3109/08820139.2011.557795 (2011).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 40.

    Gladson, C.L. & Welch, D.R. Новое понимание роли CXCR4 в метастазировании рака предстательной железы. Биология и терапия рака 7 , 1849–1851 (2008).

    КАС Статья Google Scholar

  • 41.

    Айкава Т. и др. . Глипикан-1 модулирует ангиогенный и метастатический потенциал раковых клеток человека и мыши. J Clin Invest 118 , 89–99, https://doi.org/10.1172/JCI32412 (2008).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 42.

    Уиппл, К.А., Ландер, А.Д.и Корк, М. Открытие новой молекулы, регулирующей рост и метастазирование опухоли. The Scientific World Journal 8 , 1250–1253, https://doi.org/10.1100/tsw.2008.152 (2008).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 43.

    Уэйд, А. и др. . Протеогликаны и их роль в развитии рака головного мозга. Журнал FEBS 280 , 2399–2417, https://doi.org/10.1111/февраль 12109 (2013).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 44.

    Лай, X. и др. . Сигнатура микроРНК в циркулирующих экзосомах превосходит уровни экзосомального глипикана-1 для диагностики рака поджелудочной железы. Рак письма 393 , 86–93, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2017.02.019 (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 45.

    Лорензон Л. и Бландино Г. Экзосомы Glypican-1: открывают ли они новую эру в ранней диагностике рака поджелудочной железы? Перевод Гастроэнтерол Гепатол 1 , 8, https://doi.org/10.21037/tgh.2016.01.07 (2016).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 46.

    Herreros-Villanueva, M. & Bujanda, L. Glypican-1 в экзосомах как биомаркер для раннего выявления рака поджелудочной железы. Ann Transl Med 4 , 64, https://doi.org/10.3978/j.issn.2305-5839.2015.10.39 (2016).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 47.

    Мело, С.А. и др. . Glypican-1 идентифицирует экзосомы рака и обнаруживает ранний рак поджелудочной железы. Nature 523 , 177–182, https://doi.org/10.1038/nature14581 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 48.

    Джинс, А., Готтарди, С.Дж. и Яп, А.С. Кадгерины и рак: как дисфункция кадгерина способствует прогрессированию опухоли [квест]. Онкоген 27 , 6920–6929 (0000).

  • 49.

    Hass, R. & Otte, A. Мезенхимальные стволовые клетки как всесторонние помощники в нормальной и неопластической микросреде. Сотовый общий сигнал 10 , 26, https://doi.org/10.1186/1478-811X-10-26 (2012).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 50.

    Орен, Р. и др. . Рекрутирование фибробластов как инструмент для выявления рака яичников и таргетной терапии. Int J Cancer 139 , 1788–1798, https://doi.org/10.1002/ijc.30209 (2016).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 51.

    Barcellos-de-Souza, P. и др. . Мезенхимальные стволовые клетки рекрутируются и активируются в фибробласты, ассоциированные с карциномой, с помощью TGF-β1, полученного из микроокружения рака предстательной железы. СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ 34 , 2536–2547, https://doi.org/10.1002/stem.2412 (2016).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 52.

    Cirri, P. & Chiarugi, P. Фибробласты, связанные с раком: темная сторона медали. Am J Cancer Res . 1 (2011).

  • 53.

    Шерзад, А. и др. . Мезенхимальные стволовые клетки человека усиливают пролиферацию раковых клеток за счет секреции IL-6 и активации ERK1/2. Int J Oncol 47 , 391–397, https://doi.org/10.3892/ijo.2015.3009 (2015).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 54.

    Люич, Б. и др. . Мезенхимальные стволовые клетки человека создают иммунодепрессивную среду и способствуют развитию рака молочной железы у мышей. Научный представитель 3 , 2298, https://doi.org/10.1038/srep02298 (2013).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 55.

    Ye, H. и др. . Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека, продуцируемые TGFbeta, способствуют прогрессированию и метастазированию рака предстательной железы. Cancer Invest 30 , 513–518, https://doi.org/10.3109/07357907.2012.6 (2012).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 56.

    Li, H., Fan, X. & Houghton, J. Микроокружение опухоли: роль стромы опухоли при раке. J Cell Biochem 101 , 805–815, https://doi.org/10.1002/jcb.21159 (2007 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 57.

    McAndrews, KM, Yi, J., McGrail, DJ & Dawson, MR Повышенная адгезия стромальных клеток к инвазивным раковым клеткам, регулируемая кадгерином 11. ACS Chem Biol 10 , 938, https1 ://doi.org/10.1021/acschembio.5b00353 (2015 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 58.

    McAndrews, K.M., McGrail, D.J., Ravikumar, N. & Dawson, M.R. Мезенхимальные стволовые клетки вызывают направленную миграцию инвазивных клеток рака молочной железы через TGF-бета. Научный представитель 5 , 16941, https://doi.org/10.1038/srep16941 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 59.

    Smith, N.R. и др. . Стромальная архитектура опухоли может определять внутренний ответ опухоли на терапию, направленную на VEGF. Clinical Cancer Research 19 , 6943–6956, https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-13-1637 (2013).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 60.

    Генгринович С. и др. . Глипикан-1 представляет собой протеогликан, связывающий VEGF165, который действует как внеклеточный шаперон для VEGF165. Journal of Biological Chemistry 274 , 10816–10822, https://doi.org/10.1074/jbc.274.16.10816 (1999).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 61.

    Capurro, M.I., Xiang, Y.Y., Lobe, C. & Filmus, J. Glypican-3 способствует росту гепатоцеллюлярной карциномы путем стимуляции канонической передачи сигналов Wnt. Исследование рака 65 , 6245–6254, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-4244 (2005).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 62.

    Xu, L., Yin, R., Jiang, F. & Yang, X. Glypican-5 регулирует метастазирование клеток рака легкого через сигнальный путь Wnt (1049.3). Журнал FASEB 28 (2014).

  • 63.

    Li, Y.A.N. и др. . Сверхэкспрессия глипикана-5 способствует миграции раковых клеток и связана с более короткой общей выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого. Oncology Letters 6 , 1565–1572, https://doi.org/10.3892/ol.2013.1622 (2013).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 64.

    Campbell, D.H. и др. . Обнаружение экспрессии глипикана-1 (GPC-1) в отложениях клеток мочи при раке предстательной железы. PLoS One 13 , e0196017, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196017 (2018).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 65.

    Майер, Т., Гуэлл, М. и Серрано, Л. Корреляция мРНК и белка в сложных биологических образцах. FEBS Lett 583 , 3966–3973, https://doi.org/10.1016/j.febslet.2009.10.036 (2009).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 66.

    Wilson, N. H. & Stoeckli, E. T. Sonic hedgehog регулирует свой собственный рецептор на посткроссинговых комиссуральных аксонах глипикано-зависимым образом. Нейрон 79 , 478–491, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2013.05.025 (2013 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 67.

    Qiao, D., Meyer, K., Mundhenke, C., Drew, SA & Friedl, A. Гепарансульфатные протеогликаны как регуляторы передачи сигналов фактора роста фибробластов-2 в эндотелиальных клетках головного мозга: особая роль глипикана -1 при ангиогенезе глиомы. Journal of Biological Chemistry 278 , 16045–16053, https://doi.org/10.1074/jbc.М211259200 (2003 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 68.

    Санчес, П. и др. . Ингибирование пролиферации рака предстательной железы путем вмешательства в передачу сигналов SONIC HEDGEHOG-GLI1. Proc Natl Acad Sci USA 101 , 12561–12566, https://doi.org/10.1073/pnas.0404956101 (2004).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 69.

    Vendetti, F. P. и др. . Оценка азацитидина и энтиностата как агентов, повышающих чувствительность к цитотоксической химиотерапии в доклинических моделях немелкоклеточного рака легкого. Oncotarget 6 , 56–70, https://doi.org/10.18632/oncotarget.2695 (2015).

    Артикул пабмед Google Scholar

  • 70.

    Даллаглио, К. и др. . Парадоксальные эффекты метформина на эндотелиальные клетки и ангиогенез. Канцерогенез 35 , 1055–1066, https://doi.org/10.1093/carcin/bgu001 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 71.

    Стены, М. и др. . Борьба с мелкоклеточным раком легкого, содержащим мутацию PIK3CA, с помощью селективного перорального ингибитора PI3K PF-4989216. Клинические исследования рака: официальный журнал Американской ассоциации исследований рака 20 , 631–643, https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-1663 (2014).

    КАС Статья Google Scholar

  • 72.

    Ван, Т. Т. и др. . Дифференциальные эффекты ресвератрола на андроген-чувствительных клетках рака предстательной железы человека LNCaP in vitro и in vivo . Канцерогенез 29 , 2001–2010 гг., https://doi.org/10.1093/carcin/bgn131 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 73.

    Okolicsanyi, R.K. и др. . Гепарансульфатные протеогликаны и туморогенность эпителиальных клеток рака молочной железы человека. Журнал клеточной биохимии 115 , 967–976, https://doi.org/10.1002/jcb.24746 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 74.

    Christianson, H.C., Svensson, K.J., van Kuppevelt, T.H., Li, J.P. & Belting, M. Экзосомы раковых клеток зависят от протеогликанов гепарансульфата клеточной поверхности для их интернализации и функциональной активности. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 , 17380–17385, https://doi.org/10.1073/pnas.1304266110 (2013).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 75.

    Ли, Дж. и др. . Клиническое значение циркулирующих GPC1-позитивных экзосом и его регуляторных миРНК у пациентов с раком толстой кишки. Oncotarget 8 , 101189–101202, https://doi.org/10.18632/oncotarget.20516 (2017 г.).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 76.

    Хартвиг, С. и др. . Glypican-3 модулирует ингибиторную передачу сигналов Bmp2-Smad для контроля развития почек in vivo . Mech Dev 122 , 928–938, https://doi.org/10.1016/j.mod.2005.03.007 (2005).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 77.

    Донг, З. и др. . Дифференциальная регуляция экспрессии матриксной металлопротеиназы-9, тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (ТИМП-1) и ТИМП-2 в сокультурах клеток рака предстательной железы и стромальных клеток. Международный журнал рака. Journal international du Cancer 93 , 507–515 (2001).

    КАС Статья Google Scholar

  • 78.

    Аттига Ф. А., Фернандес П. М., Вираратна А. Т., Маньяк М.J. & Patierno, S.R. Ингибиторы синтеза простагландинов ингибируют инвазивность клеток опухоли предстательной железы человека и снижают высвобождение металлопротеиназ матрикса. Исследование рака 60 , 4629–4637 (2000).

    КАС пабмед Google Scholar

  • 79.

    Вуд, М. и др. . In situ гибридизационных исследований металлопротеиназ 2 и 9 и экспрессии TIMP-1 и TIMP-2 при раке предстательной железы человека. Clin Exp Metastasis 15 , 246–258 (1997).

    КАС Статья Google Scholar

  • 80.

    Кессенброк К., Плакс В. и Верб З. Матриксные металлопротеиназы: регуляторы микроокружения опухоли. Cell 141 , 52–67, https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.03.015 (2010).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 81.

    Ролли М., Франсвеа Э., Пилч Дж., Савен А. и Фелдинг-Хаберманн Б. Активированный интегрин альфавбета3 взаимодействует с металлопротеиназой ММР-9 в регуляции миграции метастатических клеток рака молочной железы. Proc Natl Acad Sci USA 100 , 9482–9487, https://doi.org/10.1073/pnas.1633689100 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 82.

    Пал-Гош, С. и др. . Расщепление MMP9 эктодомена интегрина бета4 приводит к рецидивирующим эпителиальным эрозиям у мышей. J Cell Sci 124 , 2666–2675, https://doi.org/10.1242/jcs.085480 (2011).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • 83.

    Кояма Ю. и др. . Матриксная металлопротеиназа-9, связанная с гепарансульфатными цепями GPI-заякоренных протеогликанов клеточной поверхности, опосредует подвижность клеток аденокарциномы толстой кишки мышей. J Biochem 143 , 581–592, https://doi.org/10.1093/jb/mvn006 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • 84.

    Duan, L., Hu, X.Q., Feng, D.Y., Lei, S.Y. & Hu, G.H. GPC-1 может служить предиктором периневральной инвазии и предиктором выживаемости при раке поджелудочной железы. Asian J Surg 36 , 7–12, https://doi.org/10.1016/j.asjsur.2012.08.001 (2013).

    Артикул пабмед Google Scholar

  • 85.

    Kucia, M. и др. . Передача сигналов CXCR4-SDF-1, передвижение, хемотаксис и адгезия. J Mol Histol 35 , 233–245 (2004).

    КАС Статья Google Scholar

  • 86.

    Шор, Н. и др. . PII-LBA3 Glypican-1 как биомаркер рака предстательной железы. Журнал урологии 193 , e496, https://doi.org/10.1016/j.juro.2015.03.083.

  • 87.

    Свенссон, Г., Авад, В., Хоканссон, М., Мани, К. и Логан, Д. Т. Кристаллическая структура N-гликозилированного основного белка человеческого глипикана-1: структура двух петель, эволюционно законсервированных в глипикане-1 позвоночных. Journal of Biological Chemistry 287 , 14040–14051, https://doi.org/10.1074/jbc.M111.322487 (2012).

    КАС Статья пабмед Google Scholar

  • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.

    Можно использовать следующие HTML-теги и атрибуты:
    <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>